电离辐射的分子生物学效应-课件

电离辐射的分子生物学效应

电泳及测序DNA是电离辐射的重要靶分子纺锤体监测点（染色体结构监测点）DNA复制细胞有丝分裂异常检测DNA损伤修复机制DNA损伤类型DNA损伤检测方法细胞有丝分裂细胞骨架结构与纺锤体DNA分子组成细胞周期监测点第一节DNA分子和染色质的基本性状及分析手段DNA是电离辐射的重要靶分子原因：与其它细胞内生物大分子相比，损伤的DNA只能被修复不能被替换。伴刀豆球蛋白（ConA）具有广阔的适用性，是一种重要的生化和免疫研究试剂。ConA能沉淀多种糖类，葡聚糖和果聚糖等很多其它多糖，以及免疫球蛋白和血型物质等多种糖蛋白，还沉淀肺炎球菌多糖，并能凝集多种红细胞。如何证明DNA是细胞内电离辐射的最为重要的靶分子？致50%中国仓鼠卵巢细胞死亡的剂量DNA双螺旋结构Watson,Crick

Wilkins1962诺贝尔医学奖得主RosalindFranklin（1920～1958）DNA分子组成与分析1、核酸的组成碱基脱氧核糖和核糖核苷核苷酸多核苷酸四种核苷酸（dAMP、dCMP、dGMP、dTMP）按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多聚核苷酸就是DNA，DNA是有方向性的分子，即核苷酸的戊糖基的5′位不再与其它核苷酸相连是5′末端，核苷酸的戊糖基3′位不再连有其它核苷酸是3′末端，两个末端并不相同，生物学特性也有差异。如未特别注明5′和3′末端，一般约定，碱基序列的书写是由左向右书写，左侧是5′末端，右侧为3′末端。DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等都需要电泳完成。根据分离DNA大小及类型的不同；琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因凝胶浓度不同而异，胶浓度为0.5~0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp~50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察。并且可观察的DNA条带浓度为纳克级；原理：DNA在泳动时的分子筛效应和电荷效应，可达到分离混合物的目的。DNA在高于其等电点的溶液中带负电，向阳极移动，其迁移速率与其相对分子量成反比。DNA的等电点为4～4.5DNA分析方法——DNA凝胶电泳分子筛效应和电荷效应质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。质粒天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数（copynumber）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的载体。质粒提取原理溴化乙锭(EthidiumBromide)HealthHazardAcutetoxicity染色体结构从DNA到染色体2nm11nm30nm26从DNA到染色体300nm700nm1400nm核小体结构(Nucleosome)

第二节DNA损伤类型、检测手段和修复机制

间接作用：DNA周围其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基，这些自由基可以扩散到足够远，到达并损伤DNA，引起DNA的结构功能破坏。直接作用：电离辐射的能量直接被射DNA吸收，靶原子本身的原子可以被电离或激发，从而启动一系列的生物变化事件。电离辐射对DNA的直接作用和间接作用（一）碱基损伤碱基的脱氨基作用脱嘌呤与脱嘧啶

碱基修饰碱基修饰与链断裂细胞呼吸的副产物或者射线的能量被H2O吸收，将会造成DNA损伤，此外，体内还可以发生DNA的甲基化，结构的其他变化等，这些损伤的积累可能导致老化；这些损伤可引起DNA双螺旋的局部结构改变，每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次。DizdarogluM等人的工作表明：羟自由基“喜好”攻击嘧啶碱的5、6位，腺嘌呤的8位，

鸟嘌呤的4、5、8位。鸟嘌呤C-8位易受到羟自由基及单线态氧的攻击而发生羟化，生成加合物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）8-羟基脱氧鸟苷将会导致G到T转换,这种转换是人类肿瘤细胞最为常见的体细胞突变（somatic

mutation）8-羟基脱氧鸟苷检测方法高效液相色谱－电化学检测器分析酶联免疫吸附法应用单克隆抗体的ELISA法具有很高的灵敏度和很好的重复性，往包被抗8-OHdG抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗8-OHdG抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的8-OHdG.呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。生物素-亲合素系统亲和素（avidin）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白；耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。生物素与亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，亲和常数（K）为1015mol/L，比抗原与抗体间的亲和力（K=10.5～11L/mol）至少高1万倍。并且，二者的结合稳定性好专一性强，不受试剂浓度，PH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。由于每个亲和素能结合4个分子的生物素，这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。碱基切除修复(BER)

BER用来清除并修复异常的、不该出现的碱基。这些非A、T、G、C碱基的出现若无适时修复，则DNA聚合酶在复制的过程就很容易在碰到这些碱基时置入错误的配对，即点突变发生；。

BER优先去除基因组上的一些小的、非螺旋扭曲的碱基损伤；所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能够特异性切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为无嘌呤无嘧啶(AP)位点；。

DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA聚合酶Ⅰ合成新的片断，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链，这一过程即为碱基切除修复。糖苷水解酶切割N-beta-糖苷键形成无碱基位点（Abase

sites）,糖苷水解酶具有特异性，一种酶对应一种损伤类型；AP核酸内切酶切割，形成5’脱氧核糖磷酸，哺乳动物中最为主要的AP核酸内切酶是APE1人类中5’脱氧核糖磷酸裂解酶主要为DNApolymeraseβ(Polβ)BERDNA损伤定量试剂盒-AP位点计数由于醛反应性探针（ARP；N’-氨氧甲基羰肼基-D-生物素）特异性地与APS的开环上的醛基反应，通过这个反应可以检测到导致醛基形成的

DNA修饰AP位点检测Ecl显色原理：可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来.（二）DNA链断裂射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DNA链断裂；脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与·OH反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂；。糖基上C(1’),C(2’)和C(4’)在受到羟自由基攻击后均可形成碱不稳定性位点(alkalilabilesites,ALS)，这些位点在碱处理后都能导致DNA链断裂；

·OH从脱氧核糖上抽氢主要作用于C(3’，5’)，C(3’)上磷酸二酯键断裂多于C(5’)；

DNA双链中一条链断裂称单链断裂(singlestrandbroken，SSB)，DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂(doublestrandbroken，DSB)。1.

DNA单链断裂损伤（DNA

singlestrandbreaksSSBs）

SSBs是细胞DNA损伤的主要类型之一，是DNA经氧化应激或者碱基切除修复机制产生的一种常见DNA损伤；DNA单链断裂修复（与碱基切除修复共用一套系统）2.

DNA双链断裂损伤（DNA

doublestrandbreaksDSBs）DNA双链断裂对细胞来说是最严重也是最致命的DNA损害类型。DNA双链断裂的结果使得DNA的末端直接裸露，在这种情况的发生若没有及时的处理，细胞内DNA损害反应（DNAdamageresponse）机制就会活化，其后果之一是停止细胞的生长与分裂，或者是启动细胞凋亡；细胞内单一的DNA

DSBs即足以诱发细胞死亡。非同源末端连接(NHEJ)

是否有同源序列同源重组(HR)xx

无错vs有错Ku70/80DNA-PKcsG1SG2MSG2DNA双链断裂损伤的两条修复途径Ku70/80DNA-PKcsDNA-PKcs磷酸化末端修饰酶复合物Lig4/XRCC4/XLFDNA末端连接,复合物解离非同源末端连接(NHEJ)44pT2609pT2647pS2056ATMDNA-PKcs(10Gy)

-IR-IRshGFPshATMS2612S2624T2638T2647T2620Caspase3cleavagePI3KFATLZS2056T2609Chenetal.2007.J.Biol.Chem.282:6582-7.ATM/ATR介导DNA-PKcs自磷酸化DNA-PKcs磷酸化调控Chk2Chk2pT68ActinpS2056DNA-PKcs-KuN/KIR-NuShangetal.2014.Oncogenesis45同源重组修复(HR)

同源重组修复是利用细胞内已复制的DNA作为模板，若其中一条DNA发生双链断裂，则另一条对应的DNA序列即可当修复的模板来回复断裂前的序列，因此某些条件下被称为基因转换。DNA双链断裂损两条修复途径相互竞争AngelinaJolieBRCA1(breastcancer1)WomenwithanabnormalBRCA1orBRCA2genehaveuptoan80%riskofdevelopingbreastcancerbyage90;increasedriskofdevelopingovariancancerisabout55%forwomenwithBRCA1mutationsandabout25%forwomenwithBRCA2mutationsDNA断裂的检测方法：免疫荧光检测γH2AX聚焦点(foci)单细胞凝胶电泳脉冲凝胶电泳组蛋白变体(Histone

Variant)组蛋白变体与常规组蛋白具有高度序列同源性，核心结构相似性。γH2AX聚焦点(foci)

当外源性因素（电离辐射、类辐射药物）和内源性因素（如复制叉应激）造成细胞内染色质DNA发生断裂时，损伤应答因子ATM、ATR和DNA-PKcs快速磷酸化H2AX的第139位点，形成γH2AX；

磷酸化的H2AX(γH2AX)通过介导蛋白－蛋白之间相互作用，转导DNA损伤信号到下游分子，引发一系列的生物级联反应和细胞学反应，在DNA损伤信号转导过程中，起它的蛋白后修饰同样发挥重要作用，如泛素化、乙酰化和SUMO化等；γH2AX是迄今为止所研究的最重要的DNA损伤标志分子之一，在一定时间内，γH2AX水平与DNA损伤水平呈现一定相关性。52单细胞凝胶电泳分析如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无脱尾现象；若细胞受损，在中性电泳液（pH=8）中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星；（中性电泳）如果在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾；（碱性电泳）细胞DNA受损愈重，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强，因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞DNA损伤的程度；因其细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星实验。原理脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种分离大分子

DNA的方法。PFGE是采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。

脉冲凝胶电泳实验示意图当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正极(A+)移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场由负极向正极移动。这样，随着电场方向的交替变化DNA分子即呈“Z”字形向前移动。方框代表琼脂糖凝胶；一排小方框代表DNA加样孔；A、B代表两个交替开启和关闭的电场。

具体步骤：1、传代细胞于35mm培养皿中，至第二天约80%汇合，细胞数约5×105个；2、20Gy照射细胞，0h点细胞需在照射后立即放置冰上，其余细胞继续培养；3、加入等量的50℃的2%低熔点琼脂糖凝胶，混匀后加于以胶布临时封闭一端的制胶孔中，避免产生气泡，凝胶略高于制胶孔；4、加入等量的50℃的2%低熔点琼脂糖凝胶，混匀后加于以胶布临时封闭一端的制胶孔中，避免产生气泡，凝胶略高于制胶孔；

具体步骤：5、以刀片削去突出的凝胶，揭下胶布，将胶条推出于蛋白酶K反应液中，暂存于4℃；；6、制好的胶块50℃水浴消化24h，避免搅动；7、装配好制胶板。熔化配制好的凝胶，冷却至55-60℃（不凉也不烫手），小心倒胶于制胶板上约110ml，凝胶将没过胶块；8、等待凝胶凝固，小心拔除梳子，样品胶块将留在凝胶中；9、设定电泳条件：初始、终止脉冲时间皆为420s，电泳时间72h，角度120°，场强1.5V/cm；10、电泳完成后于凝胶成像仪上观察并拍照，注意防止过度曝光；使用QuantityOne软件分析胶孔中及电泳入凝胶的DNA含量，DNA断裂比率计算公式为：凝胶中DNA含量/(凝胶中DNA含量+胶孔中DNA含量)X100%。（三）DNA交联包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联1.DNA-DNA链交联（1）链内交联：DNA分子同一条链上的两个碱基相互以共价键结合；紫外线照射能引起较多的DNA链内交联，而电离辐射的效应较小；（2）链间交联：DNA双螺旋结构中，一条链上的碱基与其互补链上的碱基以共价键结合；DNA链间交联多见于化学损伤，如氮芥、硫芥等；放射损伤时较少见到。（1）链内交联环丁烷嘧啶二聚体6–4嘧啶–嘧啶酮光化产物NER主要修复那些影响染色质结构的DNA损伤，包括由紫外线所导致的双嘧啶键结（purimidinedimer），化学分子如cisplatin导致的DNA-DNA链间交联等；核苷酸切除修复(Nucleotideexcisionrepair,NER)这些损害的形式若没有适时的排除，DNA聚合酶将无法辨识而滞留在损害的位置，这时细胞就会活化细胞周期检查点（cellcyclecheckpoint）以全面停止细胞周期的进行；

NER分为两种途径：全基因组修复（GCR），能将损伤从整个基因组除去；转录偶联修复（TCR），能优先从表达基因的转录链将损伤除去。

DNA损伤的感应器为XPC蛋白，XPC蛋白可以结合到DNA双螺旋不稳定区域（无法形成双链），但不与错配碱基结合；全基因组修复（GCR）

XPC与RAD23B和centrin2(CETN2)形成复合物；

XP基因缺陷导致着色性干皮病(xrodermapigmentosaXP)转录偶联修复（TCR）

TC-NER是由RNA聚合酶在转录过程遇到核苷酸损害无法辨识而停滞时所活化的修复机制，借由RNA聚合酶停滞的动作可以立即招来NER相关的修复蛋白前来，这样就能加速DNA损害的复原，而无须漫长地等待GG-NER的反应；

TC-NER只能修复转录RNA的DNA链；TC-NER中起核心作用的是Cockayne综合征蛋白，CSB松散的与RNAPolII结合，当RNAPolII停留在在损伤位点时，CSB与RNAPolII结合能力增强

，并且Cockayne综合征蛋白通过WD重复区段介导CSA–CSB复合物形成。

DNA交联损伤的检测和修复主要由一组FA(Fanconianemia)蛋白来完成。FA蛋白得名于一种罕有的常染色体遗传病；范可尼贫血症，在范可尼贫血症的病人中FA蛋白以各种突变体形式存在，因而导致DNA交联损伤无法得到修复；患有范可尼贫血症的病人会在年幼时发病，出现严重的再生障碍性贫血症状，癌症，以及多发性先天畸形；

FA蛋白包括分别由FANC-A，B，C，E，F，G，L和M组成的FA核心复合体以及FANCI和FANCD2组成的ID复合体。在DNA交联损伤产生后，FA核心复合体被上游的蛋白激酶ATR所激活，从而单泛素化底物FANCI和FANCD2。（2）链间交联范可尼贫血症(Fanconianemia）是一种罕见的常染色体隐性遗传性血液系统疾病，贫血的一般表现，出血倾向及易感染。多见皮肤性着色，或片状棕色斑，体格、智力可发育落后。范可尼贫血症(Fanconianemia）FA信号通路修复链间交联的模型范可尼贫血症(Fanconianemia）病人造血干细胞池（hematopoieticstemcell

pool，HSC

pool）缺陷２.DNA-蛋白质交联

DNA与蛋白质之间也会以共价键相连，组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA共价键连接。染色质免疫沉淀法（Chromatinimmunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具，它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。染色质免疫沉淀法（Chromatinimmunoprecitation，ChIP）（四）错误配对修复(Mismatchmatch

repair,

MMR)碱基的异构互变DNA中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化(例如烯醇式与酮式碱基间的互变Dam甲基化酶，能使位于5’GATC3’序列中腺苷酸的N6位甲基化，一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始DNA合成前的几妙之几分钟内被甲基化；此后，只要两条链DNA链上碱基配对出现错误，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5’位置切开子链，然后重新合成新的子链。核心问题：如何区分哪条链为正确，那条链为错误！Dam甲基化酶与DNA错配修复1、直接修复/回复修复：a、甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）具有甲基转移酶的活性，因此可以直接将6-烷基鸟嘌呤6号位置的甲基直接移除；b、细菌中有一种光分解酶，修复UV造成的双嘧啶二聚体；2、碱基切除修复BER：针对氧化还原（8羟基脱氧鸟苷）或烷基化引起的碱基损伤，优先去除基因组上的一些小的、非螺旋扭曲的碱基损伤；3、核苷酸切除修复NER：修复紫外线、化学物质引起的DNA-DNA交联和DNA-蛋白质交联，主要修复那些影响染色质结构的DNA损伤；分为全