酶是活细胞产生的具有催化活性的蛋白质课件

第三章酶化学3.1概述

概念：酶是活细胞产生的具有催化活性的蛋白质。酶作为生物催化剂的特点：1.高效率：比非酶反应要高108-1020，比非酶催化剂催化时要高107-1013，例如过氧化氢的分解，无催化剂时不反应，用Fe催化，其反应速度不大，如果用过氧化氢酶催化此反应，其速度会增加很多。2.高度专一性：专一性绝对专一性相对专一性立体专一性基团专一性键专一性旋光异构专一性顺反异构专一性

3.对环境条件敏感酶的最佳作用条件是常温、常压、中性，如果条件发生改变，酶的催化活性则会降低。4.活性可调酶的活性可在调节因子的作用下发生变化。

3.2酶的分子组成根据酶的组成情况，可以将酶分为两大类：单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质.结合蛋白酶：其分子中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分.结合蛋白酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分包括辅酶及金属离子(或辅因子cofactor)。酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。单纯的酶蛋白无催化功能.3.2.1维生素与辅酶维生素是机体维持正常生命活动所必不可少的一类有机物质。维生素一般习惯分为脂溶性和水溶性两大类。其中脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。水溶性维生素与辅酶某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催化作用，这类分子被称为辅酶（或辅基）。辅酶是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。参与的酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。(1)维生素PP和NAD+

和NADP+

NAD+(烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I)和NADP+(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II)是维生素烟酰胺的衍生物，功能：是多种重要脱氢酶的辅酶。(2)核黄素与FAD和FMNFAD(黄素-腺嘌呤二核苷酸)和FMN(黄素单核苷酸)是核黄素(维生素B2)的衍生物，功能：在脱氢酶催化的氧化-还原反应中，起着电子和质子的传递体作用。(3)泛酸和辅酶A(CoA)辅酶A是生物体内代谢反应中乙酰化酶的辅酶，它的前体是维生素(B3)泛酸。功能：是传递酰基，是形成代谢中间产物的重要辅酶。(4)叶酸和四氢叶酸(FH4或THFA)四氢叶酸是合成酶的辅酶，其前体是叶酸(又称为蝶酰谷氨酸，维生素B11)。四氢叶酸的主要作用是作为一碳基团，如-CH3,-CH2-,-CHO等的载体，参与多种生物合成过程。(5)硫胺素和焦磷酸硫胺素(TPP)焦磷酸硫胺素是脱羧酶的辅酶，它的前体是硫胺素(维生素B1)。功能：是催化酮酸的脱羧反应(6)吡哆素和磷酸吡哆素磷酸吡哆素主要包括磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺。磷酸吡多素是转氨酶的辅酶，转氨酶通过磷酸吡多醛和磷酸吡多胺的相互转换，起转移氨基的作用。(7)生物素生物素是羧化酶的辅酶，它本身就是一种B族维生素B7。生物素的功能是作为CO2的递体，在生物合成中起传递和固定CO2的作用。(8)维生素B12辅酶

维生素B12又称为钴胺素。维生素B12分子中与Co+相连的CN基被5’-脱氧腺苷所取代，形成维生素B12辅酶。维生素B12辅酶的主要功能是作为变位酶的辅酶，催化底物分子内基团(主要为甲基)的变位反应。结构（9）硫辛酸硫辛酸是少数不属于维生素的辅酶。硫辛酸是6,8-二硫辛酸，有两种形式，即硫辛酸（氧化型）和二氢硫辛酸（还原型）.3.2.2辅酶在酶促反应中的作用特点辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型的反应。同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。3.2.3酶分子中的金属离子根据金属离子与酶蛋白结合程度，可分为两类：金属酶和金属激酶。在金属酶中,酶蛋白与金属离子结合紧密。如Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3、Zn2+、Mn2+、Co2

等。金属酶中的金属离子作为酶的辅助因子，在酶促反应中传递电子，原子或功能团。金属酶中的金属离子与配体金属离子配体酶或蛋白

Mn2

咪唑丙酮酸脱氢酶Fe2+/Fe3+

卟啉环，咪唑，血红素，含硫配体氧化-还原酶，过氧化氢酶Cu+/Cu2+

咪唑，酰胺细胞色素氧化酶Co2+

卟啉环变位酶Zn2+-NH3，咪唑，

碳酸酐酶，醇脱氢酶金属激酶中的金属离子激酶是一种磷酸化酶类，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。其中的金属离子与酶的结合一般较松散。在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。如Na+、K+、Mg2+、Ca2+

等。金属离子对酶有一定的选择性,某种金属只对某一种或几种酶有激活作用。3.3酶的结构及催化作用机制

（一）酶分子结构的特点酶活性中心：酶分子上直接参与底物的结合并对其进行催化的区域。结合部位Bindingsite酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。催化部位catalyticsite

RNase-底物复合物主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酶活性中心的必需基团酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。酶活性中心的研究方法

(1)x—射线衍射法

(2)差示标记法

(3)亲和标记法

(4)定位诱变法R

差示标记法图解A

BR+RRRRR*R*R+P-P

(a)(b)PPR用过量底物或过渡态类似物竞争性抑制剂将活性中心保护，然后用试剂R对酶活性中心以外的基团进行修饰，而后除去底物或抑制剂，再用放射性同位素的同种试剂R*与酶反应，修饰活性基团，测定同位素标记的位置，即可确定活性部位的基团。

亲和标记法

根据酶与底物特异结合的性质，设计或合成一种含有反应基团的底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。这种试剂象底物一样进入活性部位，接近结合位点，并以其活泼的化学基团与活性部位的某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征。

定位诱变法

针对一些结构资料比较齐全的酶，进一步通过单诱变（改变一个氨基酸残基）、双诱变（改变两个氨基酸残基）或多诱变（系统地改变几个相关的氨基酸残基）。对所得到的诱变酶进行系统的动力学分析、x-射线衍射分析，并与野生型酶对比，来判断被诱变氨基酸残基在结合底物、催化底物反应中所起的作用及机理。（二），酶作用高效率的机制

1，中间产物学说

在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。

E+S====E-SP+E

许多实验事实证明了E－S复合物的存在。E－S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。酶促反应：E+S===ES===ES

EPE+P反应方向,即化学平衡方向,主要取决于反应自由能变化G。而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用

2.活化能降低反应过程中能的变化反应历程：E+S=ES*=ES=EX*=EP=EP*=E+P酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力(如氢键,离子键和疏水键等)的作用，形成E-S反应中间物，其结果使底物的价键状态发生形变或极化，起到激活底物分子和降低过渡态活化能作用。

3.锁钥学说：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样4.诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.(1)酸－碱催化酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。（三）.酶催化反应机制类型

广义酸基团广义碱基团（质子供体）（质子受体）

酶分子中可以作为广义酸、碱的基团His是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。(2)共价催化

催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括His的咪唑基，Cys

的硫基，Asp的羧基，Ser的羟基等。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。

在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。（3）邻基效应和定向效应例

咪唑和对-硝基苯酚乙酸酯的反应是一个双分子氨解反应.例

实验结果表明，分子内咪唑基参与的氨解反应速度比相应的分子间反应速度大24倍。说明咪唑基与酯基的相对位置对水解反应速度具有很大的影响。(4)张力学说这是一个形成内酯的反应。当R＝CH3时，其反应速度比R＝H的情况快315倍。由于-CH3体积比较大，与反应基团之间产生一种立体排斥张力，从而使反应基团之间更容易形成稳定的五元环过渡状态。

酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。（5）底物分子形变和扭曲+—水环境+—疏水环境（6）低电介微环境：酶在催化过程中，其活性中心为疏水环境，在这种环境中，电荷之间的作用力远远大于高电介环境，大大加强了酶的催化基团与底物分子间的作用力，因而有利于降低反应活化能。有机物的电介常数为7-10，而水的电介常数为80。(四)金属离子催化作用

金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。

提高水的亲核性能

电荷屏蔽作用电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。多种激酶(如磷酸转移酶)的底物是Mg2+－ATP复合物。

电子传递中间体

许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。

3.4酶促反应的速度和影响因素在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。1，底物浓度对酶促反应速度的影响1）.米氏方程Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。米氏常数Km的意义不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。2）.米氏常数的求法

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax双倒数作图法斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax2.pH的影响在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。3.温度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。4抑制剂对酶活性的影响使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。1）抑制剂的作用方式a.不可逆抑制抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。

b.可逆抑制抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类(1)竞争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竞争性抑制作用竞争性抑制(2)非竞争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。非竞争性抑制作用非竞争性抑制(3)反竞争性抑制反竞争性抑制作用中，抑制剂只能与ES结合形成无活性三元复合物ESI而不能与游离酶结合。这种情况与竞争性抑制相反，故称反竞争性抑制。反竞争性抑制作用可逆抑制作用的动力学特征加入竞争性抑制剂后，Km变大，酶促反应速度减小。1.竞争性抑制无抑制剂竞争性抑制剂1/Vmax加入非竞争性抑制剂后，Km虽然不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了。2.非竞争性抑制无抑制剂非竞争性抑制剂-1/km

3.反竞争性抑制动力学曲线

随[I]的增加，Vmax和Km均降低，在简单系统少见，但在多元反应系统中是常见的动力模型。双底物反应动力学酶按底物的分类：异构酶：单底物AB裂合酶：单向单底物AB+C水解酶：假单底物A-B+H2OAOH+BH氧化还原酶：双底物AH2+BA+BH2

转移酶：双底物A+BXAx+B合成酶：三底物A+B+ATPAB+ADP+Pi双底物反应程序分两类：①序列反应机制

a.有序反应：如乳酸脱氢酶催化乳酸脱氢，生成丙酮酸的反应。LDH+NAD+LDHNAD++乳酸LDHNAD+乳酸LDHNADH丙酮酸LDHNADHLDH

丙酮酸NADHb.随机反应：指酶与底物结合的先后是随机的。如肌酸激酶（CK）催化的反应：

ATP+肌酸（C）ADP+磷酸肌酸（CP）②乒乓反应机制：指各种底物不能同时与酶结合形成多元复合物。如转氨酶催化的反应。

GPT-磷酸吡哆醛-丙氨酸

GPT-磷酸吡哆胺-丙酮酸

GPT-磷酸吡哆胺-α酮戊二酸

GPT-磷酸吡哆醛-谷氨酸CK丙酮酸α-酮戊二酸一、别构酶活性调节:结构：多亚基，两中心（活性中心、调节中心）3.5酶活性调节活性中心调节中心别构效应：调节因子与别构酶调节中心结合后，使酶分子的构象得到稳定或发生变化，从而使酶的活性得到稳定或发生变化，这种效应叫别构效应。

调节效应：正调节，负调节

调节物：底物—同促效应其它分子—异促效应多数别构酶具有同异促效应。

协同效应：底物与一个亚基结合后，会影响后续亚基对底物的亲和力的现象。

正协同效应：底物与一个亚基结合后，会增加后续亚基对底物的亲和力，即酶对底物的亲和力是迅速增加的。

负协同效应：底物与一个亚基结合后，会减小后续亚基对底物的亲和力，即酶对底物的亲和力是迅速减小的。v[S]50动力学曲线：

S型[S]v5090%10%0.1139非别构酶别构酶

v=10%[S]=0.11[S]=3v=90%[S]=9[S]=9

比值813优点：[S]变化小，V变化大作用：作为代谢途径中的调节酶类别构机理：序变模型SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS高活性低活性SS齐变模型例

E.coli

天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartate

transcarbamylase,ATCase）

3.别构酶举例氨甲酰磷酸天冬氨酸三磷酸胞苷氨甲酰天冬氨酸

E.coli的ATCase的亚基排列ATCase半分子（C3R3)的结构

ATCase催化链的别构过渡作用

酶分子在别的酶的催化下共价结合或脱去一个基团，使酶分子的活性产生或者丧失，这种调节方式叫共价修饰调节，这种酶叫共价修饰调节酶。如：糖原磷酸化酶催化的反应为：糖原+PiG—1—PPPPP4ATP4ADP4Pi糖原磷酸化酶激酶糖原磷酸化酶磷酸酶b型无活性a型有活性二、共价修饰调节酶真核生物的共价修饰方式主要是磷酸化/脱磷酸化，修饰以后有的酶为活性状态，而有的酶为无活性状态。糖原磷酸化酶是磷酸化后有活性，丙酮酸脱羧酶是脱磷酸化有活性。原核生物的共价修饰方式主要为腺苷化/脱腺苷化。它有12个亚基，由ATP供给腺苷酰基，腺苷化后，酶活性降低，脱腺苷化后，酶活性升高。谷氨酸+ATP+NH3

谷氨酰胺+ADP+Pi12ATP12Pi×312AAAAAAAAAAAAA活性高活性低酶1酶2如：大肠杆菌谷氨酰胺合成酶，它催化的反应为：

概念：催化反应相同，结构性质不同的一类酶

产生原因：不同的基因产生不同的肽，如酶是单体酶，则每个肽就是一个同工酶，或者酶是多亚基的，不同亚基相互组合，就形成了不同的同工酶，如：乳酸脱氢酶，由两个基因（H、M）指导合成，则有H、M两种亚基，他们之间相互组合，就会出现五种同工酶。应用：基因、遗传、发育、杂种优势检测：电泳。H亚基M亚基H4H3M1H2M2HM3M4

三、同工酶

酶的多种形式

产生的原因举例1.多基因决定的酶蛋白细胞质和线粒体的苹果酸脱氢酶2.由两条或两条以上多肽链乳酸脱氢酶的杂聚体以非共价结合的杂聚体3.遗传变遗体（等位基因酶）人类葡萄糖-6-磷酸脱氢酶4.结合的或衍生的酶蛋白

a．与其它基团结合的磷酸化酶

b．由单一多肽链衍生的胰蛋白酶原→胰蛋白酶5.由单一亚单位组成的多聚体分子量1×106和2.5×106的谷氨酸脱氢酶6构象改变酶别构效应引起的构象改变

同工酶的分类

(1)原级同工酶（primaryisoenzyme）多基因位点（multiplegeneticlocus）同工酶复等位基因（multiplealleles）同工酶(2)次级同工酶（secondaryisoenzyme）同工酶的生物学意义

(1)同工酶与遗传

(2)同工酶与个体发育

(3)同工酶与代谢调节同工酶的鉴定

(1)不同类型同工酶的性质区别

(2)同工酶类型的生化鉴定

不同类型同工酶的区别

原级同工酶性质

多基因座复等位基因次级同工酶同一种酶表面电荷

不同常不同常不同相同热稳定性不同不同或接近不同或接近相同动力学性质不同常不同常相同相同免疫学性质不同，可杂交常杂交常相同相同分子量不同，常接近几乎相同不同或接近相同粗酶样

一级结构分析

肽谱分析

末端分析亚基分离同工酶分离纯化酶带分子量测定电泳酶谱分析选择性抑制和激活实验分子量测定免疫化学分析同工酶类型的生化鉴定重组和杂交氨基酸分析动力学分析

酶谱带热稳定性分析同工酶的应用

(1)为从分子水平研究生物进化和个体发育提供理论依据

(2)作为物种生理性状和遗传的标记

(3)用于临床诊断

概念：在酶的催化下，无活性的酶的前体（酶原）转变为有活性酶的过程。如：胰蛋白酶原的激活过程。四、酶原激活

激活机理：在酶的催化下，切去酶原多余的肽段，使之成为有活性的酶。原因：形成酶的活性中心。生物学意义：保护产生酶原的组织，是生物自我保护的一种方法；也是酶活性的一种调节方式。肠激酶胰蛋白酶原胰蛋白酶酶原输送管道酶产生部位