食品生物技术概论-廖威-第五章-细胞工程及其在食品工业中的应用课件

1整体概述THEFIRSTPARTOFTHEOVERALLOVERVIEW,PLEASESUMMARIZETHECONTENT第一部分2第四章细胞工程及其在食品工业中的应用1、细胞工程概述2、植物细胞工程3、动物细胞工程4、细胞工程在食品工业中的应用实例3第一节细胞工程概述一、细胞工程发展史45请同学们讨论如何实现?西红柿—马铃薯？678细胞工程的基本技术

细胞工程是指以细胞为基本单位，在体外无菌条件下进行培养、繁殖或利用细胞融合、核移植等技术，使细胞某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改变生物品种、创造新品种和加速繁育生物个体，以及获得某些有用的细胞代谢产物的技术。细胞工程植物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体工程动物细胞工程植物细胞工程微生物细胞工程按对象分类按技术分类9植物细胞与组织培养在无菌条件下分离植物细胞或组织，将其放在适当的培养基上，给予必要的生长条件，是他们在体外继续生长、增殖与分化，形成新的组织、器官和个体的技术。10植物细胞与组织培养植物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植细胞融合仪器采用自然或人工的方法使两个或多个不同细胞融合成一个细胞的技术（标记、制备原生质体、诱导融合、筛选杂合细胞）。染色体工程11植物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体工程也叫细胞拆合，将有一个细胞的细胞核转移到另一个去除细胞核的细胞中去，从而使受体细胞获得新的遗传信息，产生新的生命现象的技术。12植物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体工程

人们按照一定的设计，有计划地削减、添加和替换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的一种技术。13第二节细胞融合技术

细胞融合产生的背景细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。

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细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术，细胞融合(cellfusion)也称细胞杂交(cellhybridization)、原生质体融合(protoplastfusion)或体细胞杂交(somatichybridization)是指两个或多个相同或不同的细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程。15在自然情况下，体内或体外培养细胞间所发生的融合，称为自然融合。而在体外使用人工方法（使用融合诱导因子）促使相同或不同的细胞间发生融合，称为人工诱导融合。人工诱导的细胞融合在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于这种技术不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。1617

18细胞融合的原理细胞膜的流动性是动物细胞融合的生物学基础。动物细胞融合技术即是利用细胞膜的这一特性，通过对参与融合的细胞通过生物、化学或物理诱导因素，使细胞膜的脂类分子的有序排列发生变化；当诱导因素解除后，细胞膜会回复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。1920一、诱导细胞融合的方法目前，诱导细胞融合的方法包括病毒、PEG、电泳冲和激光四种。其中，PEG诱导细胞融合和电诱导细胞融合是诱导动物细胞融合的常用方法。211、仙台病毒法仙台病毒又称日本血凝性病毒，引起细胞融合的有效部位在于它的细胞膜成分，特别是磷脂成分，而与核酸活性无关。两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透，两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体，进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。22232、聚乙二醇（PEG）法PEG的作用机理是PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，使溶液中自由水消失，高度脱水，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。PEG诱导融合时必须有钙离子，磷酸钙不溶于水，成为细胞间的钙桥，由此引起细胞融合。24聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程253、电融合法（electricalmediatedcellfusionorelectrofusion）电融合法是20世纪80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜出现微孔，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点是融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串。原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。26

电融合诱导法原理示意图2728细胞融合过程大致可分为四个阶段：细胞的接触、细胞质膜的融合、细胞质的重组和遗传物质的选择。29二、细胞融合的意义细胞融合不受种属的界限，可以实现种间生物体细胞的融合，是远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。2.1理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。2.2融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种的遗传物质交换提供了有效途径。302.3体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA也可以发生重组，从而产生新的核外遗传系统。2.4淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。总之，细胞融合的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围。细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作。在技术和设备上没那么复杂，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视。31三、细胞融合技术在食品工业中的应用酵母菌的育种氨基酸生产菌的育种酶制剂生产菌株的育种单克隆抗体的制备32三、动物细胞融合动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品。培育动物新品种，缩短动物的育种过程，动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，可别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成就。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但是在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对于研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。33用于生产单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体，同时还与有关医学部门合作，成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单克隆抗体。343536皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，10～14天后就要被身体排斥。如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？第三节动物细胞工程及其应用37一、动物细胞培养

1.发展历史:20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。382、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.394041动物细胞的培养过程

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是动物细胞工程技术的基础剪碎组织的目的？胰蛋白酶处理的目的？42有关概念原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养）传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。43有关概念

细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。

细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。

细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。444、动物组织细胞培养要求（1）体外培养特点:

大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。45（2）培养工具:培养瓶、培养皿、培养管、多孔培养板等。细胞培养以玻璃器皿为主。器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。46根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。

47（3）培养条件

细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。

【讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。481）恒定的温度:37℃，维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低492）PH：7.2-7.４当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。503)气体：ＣＯ２有调节PH的作用。气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。

514）营养—培养基：在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。52合成培养基

1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。人工合成培养基，如109培养液、DMEM、199、RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。53天然培养基直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。

使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞快速增殖生长。54常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。55氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有8种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子(IGFl、IGF2)等。

水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成0．5％溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。56无血清培养基动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。575)细胞培养溶液平衡盐水（BSS）：

Hanks液和Earle液是常用的BSS基础溶液。PH调整液：

NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸）细胞消化液:

胰蛋白酶溶液．EDTA溶液．胶原酶溶液58抗生素溶液：1)青、链霉素:每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素.2)卡那霉素：终浓度为50ug/ml培养液。3）制霉菌素：浓度25U/ml，小瓶分装，每瓶一次用完。596)、无污染环境

培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首