微生物发酵制药

微生物发酵制药第1页，课件共139页，创作于2023年2月2第一节概述第2页，课件共139页，创作于2023年2月3发酵：通过微生物培养而获得产物的过程微生物发酵制药：利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产一、发酵第3页，课件共139页，创作于2023年2月发酵工程的4个阶段第一阶段1676年制成第一台显微镜——微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精——酶第4页，课件共139页，创作于2023年2月第二阶段对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。第5页，课件共139页，创作于2023年2月第三阶段20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素迅速工业大规摸生产。深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。第6页，课件共139页，创作于2023年2月7发酵罐发酵第7页，课件共139页，创作于2023年2月8立式卧式摇床发酵第8页，课件共139页，创作于2023年2月9静置发酵第9页，课件共139页，创作于2023年2月10二、第10页，课件共139页，创作于2023年2月初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感第11页，课件共139页，创作于2023年2月三、常见的制药用微生物细菌放线菌真菌第12页，课件共139页，创作于2023年2月细菌之大肠杆菌属(Escherichiacoli)生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物基因工程的载体第13页，课件共139页，创作于2023年2月细菌之短杆菌属(Brevibacterium)维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。第14页，课件共139页，创作于2023年2月细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542第15页，课件共139页，创作于2023年2月细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用于甾体转化等。第16页，课件共139页，创作于2023年2月细菌之假单胞菌属(Pseudomonas)生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类；进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。第17页，课件共139页，创作于2023年2月细菌之乳酸杆菌属(Lactobacillus)生产抗癌类药物第18页，课件共139页，创作于2023年2月放线菌抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。第19页，课件共139页，创作于2023年2月放线菌之链霉菌属(Streptomyces)灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)产链霉素金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyceserythreus)产红霉素龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)产土霉素第20页，课件共139页，创作于2023年2月放线菌之诺卡氏菌属(Norcadia)生产利福霉素、蚊霉素等第21页，课件共139页，创作于2023年2月放线菌之小单胞菌属(Micromonospora)多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M.echinospora)产庆大霉素。第22页，课件共139页，创作于2023年2月放线菌之游动放线菌属（Actinoplanes）典型代表：济南游动放线菌(Actinoplanestsinanesisn)产创新霉素(creatmycin；1964)第23页，课件共139页，创作于2023年2月真菌之根霉属(Rhizopus)生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。第24页，课件共139页，创作于2023年2月真菌之曲霉属(Aspergillus)生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。第25页，课件共139页，创作于2023年2月真菌之青霉属(Penicillum)产黄青霉(Penicillumchrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸第26页，课件共139页，创作于2023年2月真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)产黄头孢霉(Cephalosporiumchrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)都生产头孢菌素C第27页，课件共139页，创作于2023年2月真菌之酵母菌属(Saccharomyces)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：生产啤酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。红酵母(Rhodotorula)：β-胡萝卜素棉病针孢酵母(Nematsporagossypii)：核黄素第28页，课件共139页，创作于2023年2月真菌之其它牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、胆碱和腐胺等生物碱。灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。第29页，课件共139页，创作于2023年2月30菌株选育、发酵和分离纯化或提炼是发酵制药的三个主要工段。四、发酵制药的基本过程第30页，课件共139页，创作于2023年2月31发酵制药流程第31页，课件共139页，创作于2023年2月32发酵制药工艺第32页，课件共139页，创作于2023年2月33菌体生长与产物合成的三个阶段：发酵前期（fermentationprophase)菌体生长期（cellgrowthphase)发酵中期(fermentationmetphase)产物合成期（productsynthesisphase)发酵后期（fermentationanahase）菌体自溶期（cellautolysisphase)五、微生物发酵基本过程特征第33页，课件共139页，创作于2023年2月34从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。pH变化：先升后降－以氨基酸为碳源，释放氨，后氨被利用。先降后升－以糖为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后被利用。发酵前期特征第34页，课件共139页，创作于2023年2月35以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间。菌体生长恒定就进入产物合成阶段。呼吸强度：无明显变化，菌体数目不增加。产物量：逐渐增加，生产速率加快，至最高峰后合成能力衰退。对外界变化敏感:容易影响代谢过程，从而影响整个发酵过程。发酵中期特征第35页，课件共139页，创作于2023年2月36菌体衰老，细胞开始自溶的一段时间合成产物能力衰退，生产速率减慢氨基氮含量增加，pH上升发酵必须结束，否则产物被破坏，菌体自溶给过滤和提取带来困难发酵后期特征第36页，课件共139页，创作于2023年2月37第二节制药微生物与产物的生物合成制药微生物的选择制药微生物的选育微生物菌种的保藏微生物代谢产物的生物合成微生物生物合成的调节第37页，课件共139页，创作于2023年2月38（1）所需培养基易得，价格低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4）单产高（5）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全一、制药微生物的选择第38页，课件共139页，创作于2023年2月39来源：大陆土壤、海洋水体样品的采集：表层土壤(0-10cm)，海洋（0-100m）预处理：根据分离目的和微生物的特性1）温度2）化学：SDS－酵母膏，CaCO3，NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。3）离心、膜分离。生产菌的自然分离第39页，课件共139页，创作于2023年2月40培养基：选择适宜的培养基，营养和pH，添加抑制剂如抗生素，制霉菌素等。分离方法：1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲溶液2）滤膜法：0.22－0.45um。细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。培养条件：放线菌25-30℃，32-37℃，45-50℃，7-14天至1月。第40页，课件共139页，创作于2023年2月41二、制药微生物菌种的选育1、选育的目的改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等2、选育的方法：A、自然选育；B、诱变育种C、杂交育种第41页，课件共139页，创作于2023年2月42定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。自然选育第42页，课件共139页，创作于2023年2月43菌种分离纯化1。稀释涂布2。平板划线纯化第43页，课件共139页，创作于2023年2月44斜面传代第44页，课件共139页，创作于2023年2月45防止菌株衰退的措施菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低.1、衰退的可能原因（1）、基因突变（2）、分离现象2、防止菌种衰退的方法

A、从菌种选育方面考虑；B、尽量减少传代次数C、创造良好的培养条件；D、利用不易衰退的细胞传代;E、采用有效的菌种保藏方法第45页，课件共139页，创作于2023年2月46原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化。原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。关键：保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。三、微生物菌种的保藏第46页，课件共139页，创作于2023年2月47菌种保藏的方法斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。第47页，课件共139页，创作于2023年2月48（1）斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长（1－6个月），传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌第48页，课件共139页，创作于2023年2月49（2）矿物油保藏法将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种（3）砂土管保藏法利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。第49页，课件共139页，创作于2023年2月50

（4）真空冷冻干燥法先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。但是手续麻烦，需要一定的设备。适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。第50页，课件共139页，创作于2023年2月51（5）其他保藏方法冷冻法：分低温冷冻（－20℃）与超低温冷冻（－196℃）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下进行真空干燥。适用于包括细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细菌的保藏第51页，课件共139页，创作于2023年2月52曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将试管放于干燥器内，室温或4℃保藏。对于细菌和真菌效果都较好。第52页，课件共139页，创作于2023年2月53国内外菌种保藏机构菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定的保藏机构仅有28家。第53页，课件共139页，创作于2023年2月54

1、我国的微生物菌种保藏机构1）普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武汉病毒研究所2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）3）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFI）4）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国医学科学院皮肤病研究所，南京卫生部药品生物制品检定所，北京中国医学科学院病毒研究所5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）农业部兽医药品检察所，北京第54页，课件共139页，创作于2023年2月552、国外主要的微生物菌种保藏机构1）美国标准菌种收藏所（ATCC）2）美国冷泉港研究所（CSH）3）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）4）日本东京科研化学有限公司（KCC）5）日本大阪发酵研究所（IFO）6）英国国立标准菌种收藏所（NCTC）7）美国国立卫生研究所（NIH）8）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）第55页，课件共139页，创作于2023年2月56第三节发酵工艺条件的确定培养基及其制备灭菌操作发酵工艺条件的确定及主要控制参数第56页，课件共139页，创作于2023年2月57培养基（medium)：供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同。

细菌：

牛肉膏蛋白胨培养基、LB

(Luria-Bertani)

放线菌：高氏一号培养基

真菌：

查氏合成培养基、PDA(Potato-Dextrose-Agar)

酵母菌；

麦芽汁培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。一培养基第57页，课件共139页，创作于2023年2月58碳源氮源无机盐水生长因子前体与促进剂消泡剂培养基的成分第58页，课件共139页，创作于2023年2月59概念：构成微生物细胞和代谢产物中碳的营养物质。作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物合成提供碳骨架。碳源第59页，课件共139页，创作于2023年2月60糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油、猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸迟效碳源:酪蛋白水解产生的脂肪酸碳源的种类第60页，课件共139页，创作于2023年2月61概念：构成微生物和代谢产物中氮素的营养物质作用:为生长和代谢提供氮源种类：无机氮源、有机氮源氮源第61页，课件共139页，创作于2023年2月62几乎所有微生物都能利用有机氮源黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、尿素有机氮源第62页，课件共139页，创作于2023年2月63氨水、铵盐和硝酸盐等。铵盐比硝酸盐更快利用。工业应用：主要氮源和辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质，如（NH4)2SO4利用后，产生硫酸生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。如NaNO3利用后，产生氢氧化钠。无机氮源第63页，课件共139页，创作于2023年2月64概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用的矿物质。作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用种类：P、S、K、Na、Mg、Ca常常添加Fe、Zn、Cu、Mo、Co、Mn、Cl，一般不加无机盐与微量元素第64页，课件共139页，创作于2023年2月65水菌体细胞的主要成分营养传递的介质良好导体，调节细胞生长环境温度培养基的主要成分。第65页，课件共139页，创作于2023年2月66概念：维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。种类：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般无需添加。生长因子（growthfactor）第66页，课件共139页，创作于2023年2月67概念：加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大变化。使用：添加前体是提高抗生素产量的重要措施多次少量添加前体（precurtsor）第67页，课件共139页，创作于2023年2月68概念：促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。种类：氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物等，起诱导作用。促进剂（accelerant）第68页，课件共139页，创作于2023年2月69概念：降低泡沫的液膜强度和表面粘度，使泡沫破裂的化合物。种类：油脂类、酯类、硅油及聚氧乙烯－聚氧丙烯甘油醚。天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。消沫剂(defoamingagent)第69页，课件共139页，创作于2023年2月70按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基等按物理性质:固体、半固体、液体培养基按化学组成：合成、半合成、天然培养基按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板固体、种子、发酵和补料培养基。培养基种类第70页，课件共139页，创作于2023年2月71概念：细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉素和丝状真菌的孢子培养基。制备：液体培养基添加1.0-2.0％琼脂粉。作用：提供菌体的生长繁殖，形成孢子固体培养基第71页，课件共139页，创作于2023年2月72单细胞培养基：营养丰富，满足菌体生长迅速，不能引起变异。孢子培养基：基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。固体培养基－要求第72页，课件共139页，创作于2023年2月73概念：供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和种子罐培养基，液体。作用：使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子种子培养基（seedmedium）第73页，课件共139页，创作于2023年2月74培养基成分必需完全，营养丰富。用速效性、容易利用的碳、氮源和无机盐等物质，但浓度不宜高。种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。缩短发酵的延滞期。种子培养基－要求第74页，课件共139页，创作于2023年2月75概念：提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基作用：不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。发酵培养基的要求：营养物质浓度和粘度适中，组成上丰富完整。不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很大，组成和配方需要优化。发酵培养基（fermentationmedium)第75页，课件共139页，创作于2023年2月76概念：发酵过程中添加补充的培养基。作用：稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标产物产量。组成：各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体制备：按单一成分配制，各自独立控制，或按一定比例制成复合补料培养基补料培养基第76页，课件共139页，创作于2023年2月77控制发酵培养基的质量第77页，课件共139页，创作于2023年2月78第78页，课件共139页，创作于2023年2月79第79页，课件共139页，创作于2023年2月80第80页，课件共139页，创作于2023年2月81培养基设计一般原则第81页，课件共139页，创作于2023年2月82二、灭菌操作工艺第82页，课件共139页，创作于2023年2月83由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的产量大为降低。一）、染菌对不同发酵过程的影响第83页，课件共139页，创作于2023年2月841）青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。2）核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。第84页，课件共139页，创作于2023年2月853）柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。4）谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。第85页，课件共139页，创作于2023年2月86种子培养期染菌染菌发生的不同时间对发酵的影响种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。第86页，课件共139页，创作于2023年2月87发酵前期染菌在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。原因：发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌补救措施：可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。第87页，课件共139页，创作于2023年2月88发酵中期染菌发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大量的泡沫，有时也会使发酵液发臭，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。措施降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。第88页，课件共139页，创作于2023年2月89发酵后期染菌由于发酵后期培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；肌苷酸、谷氨酸等地发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。第89页，课件共139页，创作于2023年2月90发酵过程污染杂菌是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量第90页，课件共139页，创作于2023年2月91显微镜检查法二）、染菌的检查和判断

用革兰氏染色法对样品进行涂片染色，显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌和杂菌的特征进行区别、判断是否染色。如发现了与生产菌形态特征不一样的其他微生物存在，就可判断为发生了染菌。此法检查杂菌最为简单、直接，也是常用的方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。第91页，课件共139页，创作于2023年2月92肉汤培养法

通常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37°C进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否染菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时此法也用于噬菌体的检查。第92页，课件共139页，创作于2023年2月93平板培养

将待检样品在无菌平板上划线，分别于37°C、27°C进行培养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否染菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37°C条件下培养6h，使杂菌迅速增值后再划线培养。

无菌实验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生浑浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。第93页，课件共139页，创作于2023年2月94抗生素发酵染菌原因分析（日本工业技术院发酵研究所）项目百分率%种子带菌或怀疑种子带菌9.64接种时罐压跌零0.19培养基灭菌不透0.79总空气系统有菌19.96泡沫冒顶0.48夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作原因10.15原因不明24.94第94页，课件共139页，创作于2023年2月95

灭菌方法

化学灭菌第95页，课件共139页，创作于2023年2月96物理灭菌第96页，课件共139页，创作于2023年2月97培养基灭菌的操作方式第97页，课件共139页，创作于2023年2月98分批操作的灭菌过程冷却降温：依次关闭排气、进气阀。罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通冷却水降温通入蒸汽，加热升温：空气管、夹套通入蒸汽，升温至70℃，取样管、放料管通入蒸汽维持保温：120℃，罐压0.1MPa，排气。调节进气和排气量，维持30min。第98页，课件共139页，创作于2023年2月99连续灭菌操作第99页，课件共139页，创作于2023年2月100连续灭菌灭菌过程第100页，课件共139页，创作于2023年2月101连续灭菌的特点第101页，课件共139页，创作于2023年2月102三、发酵工艺条件的确定及主要控制参数第102页，课件共139页，创作于2023年2月103检测仪器和主要参数第103页，课件共139页，创作于2023年2月104生物学检测的主要参数和控制第104页，课件共139页，创作于2023年2月105第105页，课件共139页，创作于2023年2月106第106页，课件共139页，创作于2023年2月107第107页，课件共139页，创作于2023年2月108物理参数的检测与控制3.发酵过程的主要控制参数与检测第108页，课件共139页，创作于2023年2月109对一种微生物来说：超过它的最高生长温度可杀死它采用它的最适生长温度可培养它低于它的最低生长温度可保存它第109页，课件共139页，创作于2023年2月110温度的选择原则第110页，课件共139页，创作于2023年2月111温度的控制方式第111页，课件共139页，创作于2023年2月112压力的检测与控制第112页，课件共139页，创作于2023年2月113搅拌的检测与控制第113页，课件共139页，创作于2023年2月114化学参数的检测与控制基质浓度pH溶解氧尾气第114页，课件共139页，创作于2023年2月115基质浓度的检测与控制第115页，课件共139页，创作于2023年2月116pH的