实验六碱法提取质粒

实验六碱法提取质粒第1页，课件共34页，创作于2023年2月目录返回标题

一．目的二．原理附：原理示意图三．试剂四．器材五．注意事项六．操作步骤1六．操作步骤2六．操作步骤3GFPuv质粒的信息图片GFPuvvector’sDescriptionLocationoffeatures1Locationoffeatures2Locationoffeatures3Locationoffeatures4Vector’sPrimerLocationPropagationinE.coli第2页，课件共34页，创作于2023年2月一．目的了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。

——三个基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化返回目录返回目录第3页，课件共34页，创作于2023年2月二．原理质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基体的实验技术。质粒的提取是利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和性质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分子易断，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等被折开，加热冷却或恢复中性PH后又呈天然构型，溶解在溶液中。这样通过加热或碱处理后又中和PH，再用离心的方法就可把质粒DNA提取出来。☆原理示意图返回目录第4页，课件共34页，创作于2023年2月☆原理示意图返回目录

返回原理第5页，课件共34页，创作于2023年2月三．试剂1.LB培养基detail2.STEdetail

3.溶液I

detail4.溶液Ⅱdetail5.溶液IIIdetail6.

3M乙酸钠(pH5.2)

detail7.TE(pH8.0)detail

返回目录第6页，课件共34页，创作于2023年2月

LB培养基

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配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl

10g摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/LNaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。第7页，课件共34页，创作于2023年2月STE

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0.1mol/LNaCl

10mmol/LTris·Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)

在15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。第8页，课件共34页，创作于2023年2月溶液I

back50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。

第9页，课件共34页，创作于2023年2月溶液II

back0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS第10页，课件共34页，创作于2023年2月溶液III

back5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。第11页，课件共34页，创作于2023年2月3M乙酸钠(pH5.2）

back在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。

第12页，课件共34页，创作于2023年2月0.5mol/LEDTA(pH8.0)在800ml水中加入186.1gEDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约20gNaOH颗粒)，然后定容至1L，分装后高压灭菌。1mol/LTris·Cl(pH8.0)在800ml水中加入121.1gTris-base，溶解后加浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，定容至1L，分装后高压灭菌。第13页，课件共34页，创作于2023年2月TE(pH8.0)

back10mmol/LTris·Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)

第14页，课件共34页，创作于2023年2月50×TAE242gTris碱57.1冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)1×TAE0.04mol/LTris-乙酸0.001mol/LEDTA(pH8.0)第15页，课件共34页，创作于2023年2月四．器材1.恒温摇床2.超净工作台3.离心机4.电泳仪和电泳槽5.玻璃器皿与耗材量筒、三角瓶、平皿;EP管(1.5ml,0.5ml);枪头(1ml,0.2ml,10μl);牛皮纸、纱布、牙签等返回目录第16页，课件共34页，创作于2023年2月五．操作步骤1

挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的3mlLB培养液中，37℃振荡培养14~16小时。取1.2ml菌液，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。加入500μl~1mlSTEbuffer，涡旋打匀，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。加入预冷的溶液I100μl，涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰浴5分钟(重悬细胞)。加入200μl溶液Ⅱ(现配)，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保持冰浴(碱变性染色体DNA、蛋白质)。在5分钟内，加入溶液III150μl，轻柔颠倒5~10次，冰浴10分钟（利用pH差异，复性质粒DNA）返回目录第17页，课件共34页，创作于2023年2月五．操作步骤2

12,000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA，及不溶的变性蛋白，取上清。上清液用Tris-HCl饱和苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提1-2次，每次剧烈振荡20秒，12,000rpm离心5分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为酚层。上清液用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，12,000rpm离心10分钟。上清液加入1/10体积3MNaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置10-15分钟。在12,000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。返回目录第18页，课件共34页，创作于2023年2月五．操作步骤3

去上清，加入1ml75%乙醇，洗涤沉淀。12,000rpm离心10分钟。去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。加入30~50μlddH2O或TE（pH8.0），溶解质粒。加入RNaseA使终浓度为20μg/ml，室温放置30分钟~1小时。1%琼脂糖凝胶电泳检测所提质粒DNA纯度及浓度。取1-5μlDNA样品，加水稀释至1ml，混匀后转入分光光度计的石英比色杯中，测定OD260及OD280，并计算OD260/OD280比值和DNA浓度：

DNA浓度=OD260×稀释倍数×50/1000（μg

/μl）返回目录第19页，课件共34页，创作于2023年2月分次收集4ml菌液离心，留沉淀第20页，课件共34页，创作于2023年2月五．操作步骤4

琼脂糖（1%）凝胶电泳称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入1×TAE，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；溶液冷至60℃，加入EB至终浓度为0.5µg/ml，混匀，注意戴手套操作；将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡；待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入1×TAE电泳buffer，让液面高出胶面1mm；在DNA样品中加入1/6loadingbuffer，混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压降选择为1-5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）；根据指示剂的位置，判断是否终止电泳。返回目录第21页，课件共34页，创作于2023年2月pGFPpBSKM第22页，课件共34页，创作于2023年2月六．注意事项

为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：加入溶液I后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5~10次)

，使蛋白质和核酸变性；加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5~10次)，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。返回目录第23页，课件共34页，创作于2023年2月周四：熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5/0.5ml离心管，装牙签及配溶液等50×TAE:500ml0.5mol/LEDTA(pH8.0):500ml1mol/LTris.Cl(pH8.0):500ml0.1mol/LCaCl2:500mlddH2O:每组100ml

5mol/L

NaOH:100ml配LB培养基液体：全班1000ml150ml×4瓶（Amp+）(终浓度为60μg/ml)，用于两个质粒的接种100ml×4瓶(Amp-)，留做感受态细胞固体（含1.5%琼脂粉）：每组100ml，共1500ml，可一起配再分装每组倒5个平板（Amp+），用于次周转化灭菌。七．实验安排第24页，课件共34页，创作于2023年2月周五：用Kit提取质粒DNA，倒琼脂糖凝胶板（1%），进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定每人分别提取pGFPuv、pBSK质粒各一管，每管60μl取1-2μl电泳，1-5μl用ddH2O稀释后在紫外分光光度计下测OD260及OD280，并计算浓度对质粒酶切过夜周六：酶切样品琼脂糖凝胶（1%）电泳用Kit对酶切后的DNA（pBSK大片段和GFP基因片段）片段进行胶回收每组用一个柱子回收电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收DNA的浓度后，存放于-20℃冰箱中七．实验安排---续第25页，课件共34页，创作于2023年2月第26页，课件共34页，创作于2023年2月GFPuv质粒的信息图片返回目录第27页，课件共34页，创作于2023年2月GFPuvvector’sDescriptionpGFPuvcarriesthe“cycle3”variantofGFPdescribedbyCramerietal.(1).ThisgenewasclonedbetweenthetwoMCSsofthepUC19derivativepPD16.43(2).TheGFPuvgenecanbeeasilyexcisedfrompGFPuv.Alternatively,theGFPuvcodingsequencecanbeamplifiedbyPCR.TheGFPuvgenewasinsertedinframewiththelacZinitiationcodonfrompUC19sothatab-galactosidase-GFPuvfusionproteinisexpressedfromthelacpromoterinE.coli.Note,however,thatifyouexcisetheGFPuvcodingsequenceusingarestrictionsiteinthe5'MCS,theresultingfragmentwillencodethenative(i.e.,non-fusion)GFPuvprotein.ThepUCbackboneofpGFPuvprovidesahighcopynumberoriginofreplicationandampicillinresistancegeneforpropagationinE.coli.返回目录第28页，课件共34页，创作于2023年2月GFPuvvector’sLocationoffeatures1•lacpromoter:95–178CAPbindingsite:111–124–35region:143–148;–10region:167–172Transcriptionstartpoint:179lacoperator:179–199•lacZ-GFPuvfusionproteinexpressedinE.coliRibosomebindingsite:206–209Startcodon(ATG):217–219;Stopcodon:1003–1005•5'MCS:234–281返回目录第29页，课件共34页，创作于2023年2月GFPuvvector’sLocationoffeatures2•GFPuvgene

Startcodon(ATG):289–291;Stopcodon:1003–1005GFPchromophore:481–489wtGFPcDNAsequences(3):289–454SyntheticGFPgenewith"cycle3"mutationsfrompBAD-GFPuv(1):455–1007Cycle3mutationF99S(T®C):584Cycle3mutationM153T(T®C):7Cycle3Cycle3mutationV163A(T®C):776Cycle3silentmutationinL137(T®C):699Cycle3silentmutationinT225(A®T):963Q80Rmutation(A®G)(4):527返回目录第30页，课件共34页，创作于2023年2月GFPuvvector’sLocationoffeatures3•GFPuvgeneArgcodonsoptimizedforE.coli:R73(AgA®CgT):505–507,R96(AgA®CgC):574–576,R12(AgA®CgT):652–654,R168(AgA®CgC):790–792,R1215(AgA®CgT):931–933Silentmutations(CccA®TccG)creatingBspEIsite:510&513Silentmutation(A®G)creatingMluIsite:612Silentmutations(TtGgaA®CtCgaG)creatingXhoIsite:709,711&714Silentmutations(AG®TC)creatingBamHIsite:811–812Silentmutation(C®G)creatingSalIsite:894Silentmutations(ActA®GctC)creatingSacIsite:993&996SilentmutationinS72(A®C):504返回目录第31页，课件共34页，创作于2023年2月GFPuvvector’sLocationoffeatures4•3'MCS:107–1091•Ampici