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文档简介

实验微丝染色及形态观察第1页,课件共13页,创作于2023年2月[目的要求]1.掌握微丝的染色方法。2.了解光镜下微丝的基本形态结构。第2页,课件共13页,创作于2023年2月[实验原理]

真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架(cellskeleton),在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同,可将细胞骨架分为微管(microtubule,MT)、微丝(microfilament,MF)和中间纤维(intermediatefilament,IF)。微丝普遍存在于多种细胞,对细胞的形状和运动有一定作用。第3页,课件共13页,创作于2023年2月

当细胞用TritonX-100溶液处理,能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质,而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏,经固定和考马斯亮蓝(非特异性蛋白质染料)染色后,胞质背景着色弱,微管等蛋白结构在光镜下无法分辨,在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维。应力纤维由平行排列的微丝组成,体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达,形态长而直,常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。第4页,课件共13页,创作于2023年2月第5页,课件共13页,创作于2023年2月

微丝在细胞内的分布特征第6页,课件共13页,创作于2023年2月[实验用品]器具:CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。材料:盖玻片培养的成纤维细胞试剂:6mmol/LPBS(pH6.5)、1%TritonX-100溶液、M-缓冲液、3%戊二醛固定液、0.2%考马斯亮蓝染液、DMEM培养液。

第7页,课件共13页,创作于2023年2月[实验步骤]1.培养在成纤维细胞进行传代培养时,将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸,放入培养皿中,于37℃、5%CO2的温箱中生长24h~48h。2.染色处理(1)取材取出铺有细胞的盖玻片,放入小培养皿中(正面向上),用PBS洗3次(从盖玻片一角轻轻滴加34滴),洗去表面的培养液。(2)抽提吸弃PBS,加入1%TritonX-100液4-5滴(刚好覆盖盖玻片表面),室温处理15min第8页,课件共13页,创作于2023年2月(3)稳定吸弃TritonX-100,立即用M-缓冲液轻轻地洗涤3次。

(4)固定略晾干,在3%戊二醛液中固定10min,再以PBS液洗3次,洗去固定液。

(5)染色滴加3-5滴0.2%考马斯亮兰染液染色10min,然后小心的用自来水漂洗。(6)观察留取少量水分封片于载玻片,吸水纸吸去多余的水。光镜下观察临时装片。第9页,课件共13页,创作于2023年2月[实验结果]光镜观察,微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色,成纤维细胞多数有突起,微丝沿突起规则排列。第10页,课件共13页,创作于2023年2月光学显微镜下微丝分布图第11页,课件共13页,创作于2023年2月

[注意事项]1.洗片时要轻柔,以免把细胞从载玻片上洗去。2.操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面。3.染色后应冲洗盖玻片背面,避免损伤细胞。4.TritonX-100抽提蛋白时,注意避免抽提时间过长而导致细胞结构的破坏。第12页,课件共13页,创作于2023年2月[作业与思

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