蛋白质一级结构测定详解课件

蛋白质一级结构测定第三章7/22/20231蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中氨基酸的组成、排列顺序连接方式和二硫键的位置。在生物化学与分子生物学中不少问题都面临着需要知道蛋白质一级结构的情况。如研究蛋白质的结构与功能的关系、酶的结构与功能的关系、一级结构与高级结构的关系等。因此，只有把一级结构研究清楚之后，我们才能研究生命过程中的许多复杂问题。7/22/20232蛋白质一级结构测定的程序蛋白质的提纯样品蛋白质的分子量确定蛋白质分子中含有几条肽链蛋白质N端和C端的测定确定蛋白质分子的氨基酸组成比二硫键和酰胺基的确定一级结构的确定7/22/20233

在进行蛋白质序列测定时，第一步工作就是提纯蛋白，用于测序的蛋白样品中不能含有杂蛋白，一般纯度要求达到97%以上或能形成结晶。样品的纯度需用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。7/22/20234

天然蛋白质分子量的测定，对于蛋白质一级结构的测定是十分重要的信息。根据蛋白质的分子量和蛋白质分子中氨基酸的平均分子量，可以大致估计蛋白质分子中氨基酸组成的数目。在蛋白质序列测定中，对分子量测定的要求不高，误差小于10%即可以。分子量的测定立法主要有：

SDS-凝胶电游泳法、超速离心法、渗透压法和层析法等。7/22/20235对蛋白质分子量测定以后，经过亚单位的拆分，比较分子量有无变化。如无变化，说明蛋白质是由一条肽链所构成；若发生了变化，说明蛋白质是由多条肽链所构成。假如是由多条肽链构成的，还要知道是相同的肽链还是不同的肽链所组成以及待分析的蛋白质由几条肽链所组成，这个工作可以用聚丙烯酰胺电泳进行测定。7/22/20236

大多数蛋白质分子中都含有半胱氨酸，两个半胱氨酸之间可以形成二硫键，如蛋白质分子中含有多个二硫键时，必须正确判断二硫键的位置，天然蛋白质中只有一种正确的二硫键的形成方式，如果二硫键的位置发生错配，将失去蛋白质的生物学活性。如有多条二硫键时，存在有多种形成方式，如牛胰核糖核酸酶有四条二硫键，存在108种可能的配对方式，但只有一种方式是有生物学活性。因此，在测序时，必须明确测出二硫键的正确位置。7/22/20237氨基酸与肽的定量组成测定

定量组成测定，第一步是将蛋白质水解为基组成氨基酸。

蛋白质的水解方法有：1、酸水解法：用6MHCl于100~120℃下在真空的安瓿瓶内进行，水解10~24小时特点：（2）天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来而转变为相应的氨基酸，酰胺基的总量由产生的氨算出。（1）所得的氨基酸不消旋；但色氨酸全部被破坏。7/22/202382、碱水解法：蛋白质与碱共热而发生水解。特点：（1）碱水解引起全部氨基酸的消旋（2）碱水解引起半胱氨酸、胱氨酸、丝氨酸以及苏氨酸的破坏（3）碱水解能保留所有的色氨酸7/22/202393、酶水解法：是最温和的水解方法。特点：（1）能保留住所有氨基酸的性质和天然构型（2）酶也是蛋白质，水解待测蛋白质的同时，自身也会被水解而改变氨基酸的组成比。在测定蛋白质的组成比时，要三种方法同时使用，互相比较最后得出真实的蛋白质中氨基酸的组成比。7/22/202310氨基酸的衍生分离及检测2，4-二硝基氟苯法（DNP）丹磺酰氯（DNS-Cl）法（DNS）邻苯二甲醛法（OPT）7/22/202311氨基酸组成测定7/22/2023127/22/202313氨基酸自动分析仪原理图7/22/202314多肽链的末端分析（氨基）端的测定（1）2，4-二硝基氟苯法（DNP）（2）丹磺酰氯（DNS-Cl）法（DNS）（3）异硫氰酸苯酯（PITC）-Edman降解法（羧基）端的测定（1）硼氢化锂法（2）肼解法（3）羧肽酶法7/22/202315

2,4-二硝基氟苯法：英国的科学家F.Sanger于1945年提出，是一个理想的氨基端测定试剂。2,4-二硝基氟苯在很温和的条件下（室温，pH8），就能与氨基酸的氨基、多肽或蛋白质的氨基末端进行反应，生成黄色的二硝基氟苯衍生物（DNP蛋白等）。

7/22/202316DNP蛋白在6M盐酸，105℃，16小时进行完全水解，只有N末端的氨基酸与2,4-二硝基氟苯反应生成二硝基氟苯氨基酸。用乙醚提出后与同样处理的标准氨基酸一起进行滤纸或薄层层析，对照鉴定末端氨基酸确定待测蛋白的氨基末端。7/22/202317

氨基端的分析7/22/2023187/22/202319

丹磺酰氯（DNS-Cl）法：Harytley等1956年报告了丹磺酰氯与氨基酸、肽或蛋白质的氨基反应产生黄色的荧光，由此产生了测定N末端的新方法，称DNS法。本法测定N末端的原理与DNP法有相似之处。但比DNP法的灵敏度提高了100倍，使用更为广泛。

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本法的优点：（1）在相当温和的条件下就能与蛋白质的肽链的N端氨基反应且反应产物很耐酸水解；（2）DNS氨基酸在紫外光激发下产生黄色荧光，可以进行荧光测定；（3）DNS氨基酸很适于电泳和层析分离，分辨率和准确度都很高，操作比较简单。7/22/2023217/22/202322丹磺酰氯（DNS-Cl）法双向层析指纹图back7/22/202323异硫氰酸苯酯法：目前应用最广泛的一种氨基末端的测定方法多肽或蛋白质与PITC在pH≈9，40℃作用时形成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（简称PTC多肽或蛋白质）后者与酸在有机溶剂中反应后，代表N末端的PTC氨基酸环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物而从肽链上掉下来，此产物可用气液色谱法进行鉴定。7/22/202324本法的优点：（1）除去N末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的，可以依照前法重复测定新生的N末端氨基酸。（2）可以用于自动化分析。7/22/2023257/22/2023267/22/202327硼氢化锂法：肽链的C末端氨基酸可用硼氢化锂还原使成相应的α氨基醇。肽链水解后，代表C末端氨基酸的α氨基醇，可用层析法加经鉴定。back7/22/202328肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用滤纸层析法鉴定。back7/22/202329羧肽酶法：羧肽酶法是C端氨基酸测定的主要方法。羧肽酶A水解蛋白质或多肽时，是从C端氨基酸开始的。每一次裂解下一个C端氨基酸残基。切下第一个氨基酸以后，还可以继续切下第二个、第三个氨基酸本法优点：按顺序从C端释放出一个或n个氨基酸残基，从而推断了蛋白质的C末端或C端的几个氨基酸的排列顺序。本法的局限性：不能切下甘氨酸、碱性氨基酸，也不能切下脯氨酸或与脯氨酸相连的氨基酸。羧肽酶A能迅速释放的C端氨基酸有：Tyr、Phe、Trg、Leu、Ile、Met、Thr、Gln、His、Ala、Val较缓慢释放的C端氨基酸有：Asn、Ser、Lys很缓慢释放的C端氨基酸有：Gly、Asp、Glu、Cys7/22/202330羧肽酶A对蛋白质的水解作用图back7/22/202331（一）色氨酸的测定：色氨酸是组成蛋白质的重要氨基酸之一，在一些蛋白质的氨基酸组成的分析数据中经常缺少这个氨基酸的数据，这是由于酸水解时色氨酸几乎全部被破坏，可用碱水解法或酶水解法加以弥补，然后再进行测定。常用的方法有以下两种：（1）对-二甲基氨基苯甲醛法：含有色氨酸的碱水解液加入对-二甲基氨基苯甲醛的浓硫酸溶液和亚硝酸钠溶液，强酸条件下反应生成蓝色化合物，590nm测定光吸收值，此法现已被广泛应用。7/22/202332（2）三价铁显色法：含有色氨酸的样品，与铁离子的醋酸溶液混合，加入浓硫酸，振荡之后呈玫瑰红色，在545nm比色测定。此法测定简便、快速，线性关系较好。但反应混合物中的含水量对显色有一定影响。因此，不如对-二甲基氨基苯甲醛法使用广泛。7/22/202333巯基的测定：巯基在蛋白质的结构与功能的研究中比其它基团更为重要，因此更引起人们的注意。测定巯基的方法有很多，不能说那一方法最好，由于pH、缓冲液、巯基与试剂反应能力以及蛋白质分子的变性程度等因素的影响，必须比较不同方法的分析结果之后才能得出正确的结论。主要方法有：形成硫醇盐法、烷基化法、比色法等，给大家介绍形成硫醇盐法。7/22/202334（1）形成硫醇盐法：重金属与巯基反应生成硫醇盐衍生物蛋白质—SH+Me+

蛋白质—SMe+H+这些金属离子主要有：银、汞、铜、镉、锌铅等。一般，采用不同量的金属离子滴定巯基，并用电位测定法测定过量的试剂。7/22/202335对氯汞苯甲酸与巯基反应，形成巯基的对氯汞苯甲酸衍生物（PCMB）。PCMB最大吸收在233nm摩尔消光值为1.96×104。与巯基形成硫醇盐以后，增加到2.2×104从图中可以看出在250nm处差值最大，这个差值与参与反应的试剂量有直接关系。测定时，用含巯基化合物支滴定固定量的汞试剂，直至吸收差值不再增加为止，根据汞试剂的量可以计算出巯基数量。由于测定是在蛋白质的吸收范围内进行，因此必须作蛋白质含量对吸收影响的校正。7/22/202336亚基的拆分：蛋白质亚基之间是以非共价键联接在一起的。如：氢键、疏水基团的相互作用、离子键等。这些都是较弱的键，可以在温和的条件下将其拆开。常用的方法有pH的改变和强变性剂（8M尿素、6M盐酸胍等）（1）pH的改变：这是最简便的方法，并且在很多情况下可行的方法。对蛋白质来讲，解离的临界pH范围大约在pH3~4（羧基滴定范围）和pH9~10（赖氨酸-酪氨酸滴定范围）当滴定蛋白溶液的pH低于3或高于10时可能就会引起亚基的解离。（2）强变性剂：大部分蛋白质在尿素或盐酸胍的浓溶液中发生变性而使亚基解离。7/22/202337二硫键的拆开：如果蛋白质中的两条肽链是通过二硫键联接，就需要较强的条件将二硫键切断，拆开肽链。切断二硫键主要采用氧化法和还原法。氧化法：常用的氧化剂为过氧甲酸，将二硫键的硫氧化为磺酸基。此法的优点为二硫键拆开后，不能重新形成二硫键。缺点是在氧化二硫键的同时，将肽链中的蛋氨酸侧链氧化为亚砜，色氨酸侧链被破坏。还原法：常用的还原剂有二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇，巯基乙酸等，将二硫键还原为巯基。此法的优点为条件温和，不破坏肽链中的其它氨基酸。缺点为还原后的巯基还会重新形成二硫键，常用封闭基团对拆开的三硫键进行封闭而加以保护。7/22/2023387/22/2023397/22/202340氨基和酰胺基的测定：（1）氨基测定：使用2，4，6-三硝基苯磺酸鉴定蛋白质和肽中游离氨基，方法比较灵敏。该试剂在温和条件下与—NH2定量反应，产生相应的三硝基苯衍生物。该试剂与组氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基等没有反应。氨基的三硝基苯衍生物可用分光光度法定量测定。（2）酰氨基的测定：首先将酰胺水解成氨，然后进行测定。水解条件为浓盐酸37℃水解10天或用2M盐酸100℃水解2小时。最后，通过测定产生氨的量，测定酰胺的量。back7/22/202341肽链的部分裂解及肽片段的分离

蛋白质一级结构的测定，就目前的测定方法来看，只能测定小于50个氨基酸残基的小片段，当肽链长度超过50个氨基酸残基后，测定的准确性明显降低。因此，在蛋白质序列测定前，必须将蛋白质裂解为一些小的片段，分别对小片段进行测定，然后再将小片段拼接在一起而完成蛋白质一级结构的测定工作。7/22/202342肽链的部分裂解肽链的部分裂解化学裂解法酶解法专一性化学试剂法部分酸水解法7/22/202343溴化氰（CNBr）裂解：该方法是化学裂解方法中最好的方法。它与蛋白质中的蛋氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内脂，进一步与水反应，将肽键断裂。N端一侧肽段的C端成为高丝氨酸内脂，C端一侧肽段的N端不变。7/22/2023447/22/2023457/22/2023467/22/2023477/22/202348部分酸水解法：F.Sanger早期研究胰岛素的一级结构时使用了稀酸部分水解的方法。部分酸水解法一般分稀酸和浓酸两种条件。在稀酸的条件下，天冬氨酸后面的肽键容易断裂，在pH2.5时水解相当完全。在浓酸条件下，含羟基的侧链残基右侧肽键容易断裂。酸水解法虽然有一定的规律性，但其专一性仍不如其它方法。7/22/2023497/22/202350

用溴化氰裂解法可以得到一套裂解的肽段，通常得到的片段较大，这样的大肽段不易直接测定氨基酸的排列顺序，要进行多次裂解，才能得到合适的测序片段。而且，测序时，将蛋白质分解为小的片段，测定后再拼接成完整的蛋白质一级结构，拼接时，必须用多套肽段重叠比较才能得出其一级结构。因此，测序前要有两套以上的裂解肽段，才能完成蛋白质的一级结构测定。7/22/202351蛋白酶的专一性：胰蛋白酶R1=Lys或Arg侧链糜蛋白酶R1=Phe、Trp、Tyr侧链胃蛋白酶R1=Phe、Trp、Tyr侧链嗜热菌蛋白酶R2=Leu、Ile、Val侧链7/22/202352

在酶解法中，胰蛋白酶的专一性最强，只切断以赖氨酸或精氨酸为C末端的肽段。肽链经过胰酶裂解之后应该得到n+1个肽段。N是赖氨酸和精氨酸的总数。若水解产生了游离的赖氨酸或精氨酸时，肽段数小于n+1。在典型的蛋白质中，赖氨酸和精氨酸的总数约占10%，产生肽段的平均长为10个氨基酸残基左右，非常适合顺序测定。

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若将肽链进行适当的化学修饰，可扩大胰蛋白酶的使用范围。如将赖氨酸的ε-氨基修饰后，胰酶专一性地水解肽链中精氨酸的部位；如果肽链中赖氨酸和精氨酸数量太少，可将半胱氨酸修饰后转变为胰酶的水解位点。7/22/202354蛋白质部分裂解后肽片段的分离

初分离：常用凝胶过滤法分离程序再分离：常用离子交换法提纯：常用电泳、纸层析、薄层层析或电泳层析结合法7/22/2023557/22/202356初步分离的肽段，一般用离子交换柱层析法进一步提纯。较大的肽段一般用离子交换纤维素或离子交换葡聚糖凝胶。较小的肽片段多用离子交换树脂（Dowex50、Dowex1等）洗脱方式一般用pH或盐浓度梯度洗脱法。注意：肽段的分子量一般较小，脱盐是很困难的。因此，洗脱时一般采用挥发性缓冲液。7/22/2023577/22/202358

经过初步分离的水解片段尚需高压电泳、纸层析或薄层层析进一步提纯。这些方法分离效果很好，只是得量很少。特别是一相用纸层析，一相用高压电泳的方法，不仅可以用来分离肽段和鉴定肽段的纯度，而且可以从水解得到的肽段混合物的层析-电泳图谱（指纹图）来研究蛋白质结构的差异。7/22/202359部分水解片段的序列测定序列测定常用方法异硫氰苯脂法（Edman降解法）DNS-Cl-Edman法酶解测序法蛋白质顺序测定仪7/22/202360异硫氰酸苯脂法，是蛋白质序列测定中最常用的方法。首先，异硫氰酸苯脂与肽片段的N-末端反应生成异硫氰酸苯脂氨基酰肽。与异硫氰酸苯脂结合的N-端氨基酸水解后以苯乙内酰硫脲衍生物释出，同时释放C-端完整肽链。C-端完整肽链可连续进行测定，苯乙内酰硫脲衍生物经提取后用于层析鉴定。本法在顺利的情况下，可以确定十个或更多的氨基酸排列顺序。7/22/202361

DNS-Cl-Edman法是DNS法和Edman法的有机结合。该法的最大优点是灵敏度进一步提高，一毫微克的样品即可进行测定。测定程序如下：（1）将微量样品真空干燥，用水溶解后取出少量样品用DNS法测N端氨基酸，确定N端第一个氨基酸；剩余的样品进行Edman降解后，再取少量样品用DNS法测N端氨基酸，如此反复循环后，测出整条肽链的顺序。7/22/2023627/22/202363酶解法测定顺序：利用外肽酶（N-肽酶和C-肽酶）对蛋白质从N-端或C-端进行逐个氨基酸的水解，从氨基酸的释放顺序测定氨基酸的排列。此法在酶解时，往往在肽链的第一个氨基酸还没有释放完全时，第二个氨基酸已经开始释放，必须用氨基酸释放时间与氨基酸释放量的关系做图，才能求出氨基酸在肽链中的顺序。但有时也会出现第二个氨基酸释放速度与第一个氨基酸释放速度相同的现象，在这种情况下将不能用此法测定。7/22/202364到目前为止，没有任何一种可以测定超过50个氨基酸残基的方法。而且随着肽链的延长，测定的准确性会大大的降低。因此，都是将蛋白质水解为小肽段，再测定小肽段的顺序，最后将小肽段拼接为完整的蛋白质的一级结构。当蛋白质水解后，产生了水解位点的n+1个水解片段。提纯分离后，这些片段的位置被打乱，Sanger利用两套水解片段重叠法，最终解决了这一难题。部分水解肽段的顺序确定7/22/202365N-赖谷苏丙丙丙赖苯谷精谷胺组蛋天