AKP活性检测27日教学课件2

AKP活性检测27日AKP活性检测27日AKP活性检测27日Q&A关于噬菌体污染处理：

1、环境用漂白粉灭菌；2、用消毒液浸泡相关器具；

3、菌种室甲醛熏消一夜；4、福尔马林溶液浸泡；5、更换或交替使用发酵剂；6、采用抗性菌株；特征：

1、培养液变澄清；

2、养份没有被正常消耗；3、噬菌斑：菌液涂板后出现溶菌透明圈，即噬菌斑；污染原因：菌体自带噬菌体(特别是溶源性细菌);

环境中存在；表达产物AKP蛋白的检测基因的克隆与表达专题之八蛋白检测指标1、质活性分子量定性结构2、量表达产率获得产量蛋白浓度纯度根据蛋白的特性Western，测序等电泳，分子筛，沉降系数等光/色谱，晶体衍射等分光，凯氏定氮等电泳，沉降、晶体衍射等1、酶活测定：底物显色法AKP405nm有特征吸收本实验410nm测定OD值pNPP（对硝基酚磷酸）无色＋PipNP（对硝基酚）黄色Na3PO4比尔-朗伯定律：ODλ=єLCεpNP=17500L·mol-1

·cm-1

C:光吸收物质的浓度（mol·L-1）L:光路长度（cm）1、酶活测定：底物显色法（其中n为稀释倍数）酶活力单位数＝

注:通过调整稀释倍数控制OD410在0.1～0.8之间30℃反应10min加入3.6ml终止液终止反应于410nm处测定吸光值40μL酶液360μL测活液+实验操作1.菌体加入15mL匀浆液2.超声破碎：输出功率1200w，超声2秒，间隔10秒，超声次数：40次3.粗匀浆制样：细胞破碎液200uL＋4x样品处理液100uL+匀浆缓冲液100uL

90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。4.匀浆上清制备：

另取1.0mL细胞破碎液，4℃,12000rpm×10min离心，留上清液5.上清液制样：

匀浆上清200uL＋4x样品处理液100uL+匀浆缓冲液100uL，

90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。一、细胞破碎与制样组别空白

零对照空载体表达阴性对照

(蓝斑)pETBlue-AKP

阳性对照AKP表达粗匀浆上清粗匀浆上清匀浆液（uL）4000000粗匀浆（uL）040400400离心上清（uL）00040040测活液（uL）360360360360360360室温反应10min终止液（mL）3.63.63.63.63.63.6OD410酶的活力二、AKP酶活性分析谢谢！自然胶电泳；变性胶电泳等电聚焦梯度胶电泳印迹转移电泳双向电泳

2、分子量测定：SDS电泳SDS变性胶电泳用途：

亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等凝胶电泳的分类：丙烯酰胺

甲叉丙烯酰胺TEMED(加速剂)APS(过硫酸铵,催化剂)聚丙烯

酰胺凝胶T分离范围（KD)１５１２－４３１０１６－６８７.５３６－９４５.０５７－２１２T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度

改变T值改变胶孔径一般按a:b=29:1

或a:b=29.2：0.8配制储液a：丙烯酰胺的量

b：甲叉丙烯酰胺

m：溶液的总体积C：表示交联剂所占百分比a+bT=m

*100%Cba+b

*100%

=

PAGE凝胶电泳原理SDS的浓缩效应电泳体系为不连续体系电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成电荷效应：Cl－的快速泳动在其后面形成低电导、高电压梯度区带动Pr－和Gly－快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr－浓缩成狭小薄层Gly－、

Pr－、Cl－分离胶pH8.8（12%）－Tris-GlypH8.3＋Tris-GlypH8.3浓缩后的样品浓缩胶pH6.8（4%）未浓缩的样品SDS的浓缩效应SDS的变性作用SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开∴二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质－SDS复合物由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比∴SDS中，SDS－蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关-分子筛效应实验操作1.洗净胶板，架好和固定好胶板

2.配置12%分离胶（20mL）

3.分离胶混匀后用5mL枪头加入两玻

璃夹缝中，并小心在胶面上加入

1cm蒸馏水，37℃约20－40min后胶自然凝聚

4.配制4%浓缩胶（10mL），浓缩胶混匀后，迅速倾斜倒出蒸

馏水，将浓缩胶加入两玻璃夹缝

5.在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm的梳子，浓缩胶凝固后将凝胶装入电泳槽，在槽中加入1×SDS电极缓冲溶液，小心拔出梳子AKP的SDS－PAGE电泳1).电泳加样：将制备好的样品点甩离心后，按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品（20uL-30uL）和分子量Marker（10uL）。

（注意：同时进行顺序和样品完全一致的两组胶的电泳，以备分别进行染色和Westernblotting分析）2).电泳：浓缩胶部分电泳条件：80V恒压电泳；

分离胶部分电泳条件：120V恒压电泳。

当溴酚蓝移动到前沿时，切断电源，停止电泳从电泳槽中取出胶板，小心剥离凝胶，并将凝胶切成两部分。

其中：一部分用R250染色、脱色和观察结果另一部分准备免疫印迹6、电泳1).染色：将胶置于20mL的R250染色液中染色2h3).脱色：将胶转移至20mL的脱色液中脱色1.5h，以目的条带清晰显示为准3).观察结果：凝胶成像仪照相并保存结果4).胶的保存：将胶转移至20mL的保存液中，可常温保存很长时间。7、染色、脱色与保存空载体离心后离心前MKd9766533614谢谢！

印迹(blotting)是70年代中后期出现的一种生化技术印迹类似于吸墨迹的过程它常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交及许多灵敏的检测技术相匹配而进行广泛应用于DNA、RNA、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大分子的研究

电泳转膜固定/封闭抗体结合检测

3、蛋白定性：WesternBlotting

WesternBlotting基本流程P1:凝胶电泳P2:转膜(印记）

P3:封闭P4:结合一抗P5:结合酶标二抗P6:显色1）印记方式：虹吸作用转移电转移真空转移斑点/狭缝印记2）膜与蛋白结合方式：非共价结合＋半干式转移装置滤纸凝胶NC膜—P2:转膜(印记）3）膜的种类：硝酸纤维素膜（NC膜）

尼龙膜印迹在NC膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。一般经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。

一抗对抗原是特异的。酶标二抗是商品化的，对某种动物的一抗都可以反应。

二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、生物素、同位素等标记。辣根过氧化物酶的底物有DAB（二氨基联苯氨），OPD(邻苯二氨）等

P4-P6:结合一抗，结合酶标二抗，显色膜蛋白一抗HRPHRPHRPHRP酶标二抗H2O２DAB-H+H2O2２DAB+显色(四甲基二氨基联苯氨)1.阴性对照2.实验组匀浆4.阳性对照3.实验组上清1234实验操作P1:凝胶电泳P2:转膜(印记）

P3:封闭P4:结合一抗P5:结合酶标二抗P6:显色

AKP的WesternBlotting1.另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少30分钟（甲醇的作用）2.正极上铺三层和凝胶一样大小的滤纸，然后依次将硝酸纤维素（NC）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸干“三明治”样结构周围的印迹缓冲液，并压上负极

（注意不要有气泡）

(短路与断路)3.恒流1.0mA/cm2转移1.5hr4.转移结束后将NC膜取出，

凝胶继续用R250染色以便分析

转移的完全程度5.NC膜至于5%脱脂奶粉中，

4度封闭一周，待用。＋半干式转移装置滤纸凝胶NC膜—非特异结合6.

一抗结合：倒去封闭液，

加入一抗（1xPBS按1：100稀释）

370C轻轻摇动，孵育60min7.

漂洗：1xPBS清洗3次(每次漂洗5min)8.二抗结合：按1：1000稀释二抗（偶联辣根过氧化物酶）

370C轻轻摇动，孵育60min9.漂洗：

1xPBS清洗3次(每次漂洗5min)10.显色：用显色液显色至出现清晰条带，

加水冲洗终止显色反应6.到去封闭液，加入1xPBS稀释的一抗（稀释的倍数为ELISA所测效价的1/10），加入的一抗工作液覆盖住膜即可。370C轻轻摇动，孵育45min7.1xPBS清洗3次后(每次漂洗5min)，加入按1：500倍稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗。370C轻轻摇动，孵育45min8.1xPBS清洗3次(每次漂洗5min)，用显色液显色至出现清晰条带，加水