人体显微形态学技术1课件

人体显微形态学技术主讲教师：胡先明

Tel-mail:huxianming530@126.com课程定义

《人体显微形态学技术》是一门把显微制片技术的核心内容与现代组织学的主要实验技术整合在一起的、独立开设的、综合性实验课程。

课程的主要内容1、显微制片技术的一般原理和程序2、非切片技术（涂片、铺片、压片的制作，以及固定与染色）3、石蜡切片技术（细胞器及人体不同组织切片的制作与固定染色）4、人体病理标本的制作方法（病理组织切片和人体病理大体标本的制作）4、免疫组织化学技术与方法5、显微镜技术与大型仪器设备的操作与使用课程的应用范围

《人体显微形态学技术》是研究人体组织（正常与病变）和细胞结构的重要方法和手段，在教学、临床和科研领域被广泛应用。教学目标与目的1、理解显微制片技术的一般原理和程序2、掌握非切片制作方法和石蜡切片制作方法3、掌握人体病理大体标本的制作方法4、了解免疫组织化学技术与方法5、对学生的实验技能进行综合训练，培养学生的综合分析能力、实验动手能力、创新能力和实践能力。教学方法与教学模式

教学方法

实际操作与理论讲授相结合，以实际操作为主。

教学模式授课时间选择在自由度较高晚上或周末，以保证综合性实验的连续性操作与顺利实施。考核方式与成绩产生

考核方式：

理论考试和切片数量与质量的检查

考核产生：

理论考试成绩20%切片数量与质量60%平时成绩20%（操作能力与出勤次数）

教学参考书：自编显微制片技术概述一、显微制片的目的与意义使切片标本能够在光学显微镜下充分显示人体各种组织细胞的不同结构和形态、以及它们之间的相互连接和它们之中的某些化学成分和含量的变化。为人类研究各种组织细胞的细微结构变化提供最直观的依据。二、显微制片种类（一）切片法固定-脱水-透明-包埋-切片-染色–封固（二）非切片法1、涂片2、压片3、磨片4、铺片5、消化分离三、显微制片的程序（一）取材与固定（二）固定后处理（三）脱水与透明

（四）浸蜡、包埋和切片（五）染色与封片

显微制片的一般原理与程序一、取材（一）动物处死1、动物处死的要求2、动物处死的方法（二）取材的方法1、动物选择2、部位选择3、切面方向选择（三）取材要求1、新鲜2、小而薄1.5cm×1.5cm×0.5cm3、保持原有的形态4、注意环境温度的影响5、刀、剪要锋利（三）固定的注意事项1、固定液的用量：组织的20倍为宜2、固定液的配制：现配现用最好3、固定时间：一般情况24小时即可（四）固定后处理1、流水冲洗2、酒精洗涤3、碘酒脱汞4、脱甲醛色素5、脱钙处理二、固定（一）固定的目的保持组织细胞在机体生前的结构和状态，便于染色和制片。（二）固定的方法1、直接固定2、蒸汽固定3、灌注固定4、全身固定三、固定液（一）单纯固定液1、甲醛10%--20%2、乙醇80%--90%3、冰乙酸2%--5%4、升汞5%--7%水溶液5、苦味酸饱和水溶液6、重铬酸钾1%--3%水溶液7、丙酮原液8、铬酸0.5%--1%水溶液（二）混合固定液1、中性甲醛固定液（甲醛磷酸二氢钠磷酸磷酸氢二钠）2、乙醇--甲醛固定液（A-F液）3、Carnoy

,s固定液（乙醇冰乙酸氯仿）4、Bouin

,s固定液（苦味酸甲醛冰乙酸）5、Altmann

,s固定液(重铬酸钾锇酸）6、Zenke

,s固定液(重铬酸钾升汞冰乙酸）四、脱水（一）脱水的意义用一定的化学试剂将组织中的水分置换出来的过程，称脱水。其意义在于：使透明剂能渗入组织中。（二）脱水剂的种类1、乙醇2、丙酮3、正丁醇五、透明（一）透明的意义用一定的化学试剂将组织中的脱水剂置换出来的过程，称透明。其意义在于：使包埋剂能渗入组织中。（二）透明剂的种类1、二甲苯2、苯甲酸甲脂3、三氯甲烷（氯仿）六、浸蜡（一）浸蜡的意义用石蜡（包埋剂）将组织中的透明剂置换出来的过程，称浸蜡。其意义在于：使包埋剂能渗入组织中，作为组织的支撑剂，有利切片。（二）石蜡的种类

1、软蜡（熔点在48--50。C）

2、硬蜡（熔点在60--62。C）

3、蜂蜡（不能作为单独的包埋剂）（三）浸蜡的过程1、二甲苯与软蜡等量一次2、软蜡两次3、硬蜡两次以上操作均在恒温箱里进行，每次浸蜡的时间在20min—1h左右。七、包埋将已经浸过硬蜡的组织置入包埋器中，倒入已经熔化的硬蜡的过程，称包埋。其冷却凝固后蜡块，称组织包埋块。

包埋过程的注意事项：1、做好包埋盒（两块L型金属块或纸盒）1、组织置入包埋盒中动作要快2、包埋镊要加温3、组织切面朝下八、切片（一）器材准备切片前要准备好如下器材：刀片、经清洁处理后的载玻片、弯头眼科镊、毛笔、贴片容器、温度计、蛋白甘油等。（二）切片1、组织包埋块整修2、选好切面部位3、安置组织包埋块在切片机上（三）贴片将切好的蜡带分成小段成蜡片，贴于载玻片上的过程，称贴片。贴片过程的注意事项：1、贴片前载玻片上要涂抹少许的蛋白甘油2、蜡片不要贴在载片的中央，应稍靠左侧一点。3、蜡片不能有皱褶4、贴片完成后不能立即染色，必须放入40。C的恒温箱中烘烤3—4天。九、染色与染色程序（一）染色的概念与意义

染色就是染料和组织细胞的分子相互的结合，使组织细胞着色的过程。（二）

染色的目的与意义：使组织细胞在光学显微镜下能够清晰显示组织细胞的细微结构。目前用于组织细胞染色的染料种类及染色的方法很多。（三）染料简介染料是指分子中含有发色基团和助色基团的、有鲜艳色彩的、并对组织有极强亲和力的有机化合物。染料的种类有天然与人工合成两类，一般是按染料的化学性质进行分类。1、碱性染料2、酸性染料3、中性染料4、金属染料5、荧光染料（四）染料的选择染料的种类很多，至于选择什么样的染料对组织细胞进行染色，这要根据实验的目的进行选择。例如：1、观察细胞核可选择苏木精染色2、观察染色体可选择Giemsa染色3、观察高尔基体可选择硝酸银染色4、观察运动终板可选择氯化金染色5、观察组织细胞的结构可选择苏木精与伊红复染（五）染色程序

1、脱蜡将烘干的切片置入透明剂中把组织中的石蜡替换出来的过程，称脱蜡。脱蜡过程的注意事项：脱蜡必须彻底，否则会严重影响染色。一般要求在纯二甲苯中进行2-3次，每次10--15min。

2、入水（复水）用脱水剂将组织中的透明剂置换出来的过程，称入水。入水过程的注意事项：①在100%的乙醇中2次，每次2-5min②95%以后由高浓度向低浓度逐级下行，直至蒸馏水，每次2--5min.③在自来水和蒸馏水冲洗的过程中，水流不宜过大，时间也不宜过长，30秒或1分钟即可。

④染色以HE染色为例HE染色的流程H代表苏木精（hematoxylin)E代表伊红（Eosin)二甲苯脱蜡乙醇脱水自来水冲洗蒸馏水冲洗苏木精染色1%盐酸酒精分色自来水冲洗饱和碳酸锂中返蓝自来水冲洗蒸馏水冲洗入80%的乙醇伊红染色乙醇脱水二甲苯透明中性树胶封固显微制片的基本仪器设备设备类：显微镜，切片机，自动脱水机，包埋机，烤箱，冰箱，恒温箱，纯水仪，离心机，分析天平，磁力搅拌器等