一起轮状病毒中毒案例分析

卫检综合微生物案例分析-3汇报人/邓武田海孟

李文艺陈建【案例】3

患儿，半岁，女。以突然发病出现发热、水样腹泻和呕吐等症状于2012年11月5日急诊入院，询问病史患儿为早产1个月，人工喂养，体检轻微脱水症，蛋花样粪便，体温38℃。患儿起病急，出现发热、水样腹泻和呕吐等症状，发病时间为深秋，体检轻微脱水征，蛋花样粪便。【讨论题】你作为检验人员，如何进行采样并进行实验室检验确诊？1.案例分析2.样品采集及前处理3.实验室检测4.预期结果目录案例分析011、急性水样便腹泻，多为轮状病毒或产毒素性细菌感染。小儿尤其是2岁以内婴幼儿，发病在冬秋季节，以轮状病毒肠炎可能性大；发生在夏季以产肠毒性大肠杆菌（ETEC）肠炎可能性大。2、根据患儿表现出的症状（发热、水样腹泻、呕吐、蛋花样粪便）以及患病时间（深秋季节），高度怀疑为患儿感染了轮状病毒（rotavirus）；3、但同时还应该考虑到一些常见细菌的感染，例如：致病性大肠杆菌（蛋花样粪便）、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。4、喂养不定时、不当或以淀粉食品为主食，或饮食脂肪过多以及断奶后突然改变事物品种，均能引起轻~中度腹泻（消化不良）。气候突然变化，腹部受凉肠蠕动增加；天气过热，消化液分泌减少；由于口渴，乳脂过多，增加消化道负担，均易诱发腹泻。大便为稀薄或蛋花汤样，无脓血和酸臭味，如不及时控制，极易引发肠道感染。案例分析样本采集及前处理024321取30g奶粉于无菌采样袋中，密封患儿血液：患儿粪便：奶瓶：婴儿奶粉：洁净棉拭子采样采样杯采集婴儿新鲜粪便，0℃保存普通真空采集管采集患儿足跟血；样本种类及采样方式56接触物品：接触人群的手：洁净棉拭子采样洁净棉拭子采样实验室检测03Part1Part2Part3实验室检测动态血常规检测CRP值检测细菌学检验病毒学检查患儿血液血常规检测CRP值检测分离平板上未见可疑菌生长病毒检测直接接种平板:B-P平板(37℃,24h)、MAC/SS/HE平板(35~37℃，24h)接种平板分离：B-P平板、SS/HE、MAC增菌：7.5%Nacl或胰酪胨蛋白肉汤(37℃,24h)TTB增菌液（42℃,24h）GN肉汤(35℃,24h)患儿粪便接触物、手、奶瓶棉拭子标本奶粉溶解液实验室检测流程图血常规监测在临床上可以通过动态血常规检测、CRP值检测来对两种疾病新生儿进行初步鉴别。轮状病毒感染新生儿通常有发热及轻微消化道症状，易与严重细菌感染的新生儿混淆。从严重细菌感染新生儿的WBC、CRP检测结果来看，发病初始阶段（<12h）的WBC、CRP水平与轮状病毒感染新生儿无无显著差异，但发病24h后则显著高于轮状病毒新生儿。轮状病毒检测轮状病毒：轮状病毒基因组由11个不连续的dsRNA节段组成，分别编码6个结构蛋白(VPI—VP4，VP6和VP7)和5个非结构蛋白(NSP1一NSP5)。VP6是内层衣壳的主要成分，具有组和亚组抗原性，不同株轮状病毒VP6蛋白具有高度保守性。检测方法的选择01real-timeRT-PCR检测A组轮状病毒的灵敏度优于其他4种方法,可用于轮状病毒的高通量检测;ELISA和胶体金具有良好的灵敏度与特异性,且胶体金成本低,非常适合于初筛检测。行业标准推荐的RT-PCR尽管特异性较高,但灵敏度偏低,有待改进，ELISA法诊断效能优于胶体金法，胶体金法敏感、快速、单独样本可随时检测。综上本小组选用胶体金法作为初筛方法real-timeRT-PCR作为确诊方法检测方法的选择01胶体金免疫层析法原理：以抗A组轮状病毒多克隆抗体包被硝酸纤维素膜、以胶体金标记的小鼠抗A组轮状病毒VP6单克隆抗体为结合物，利用免疫层析原理来检测粪便标本中的轮状病毒抗原。将试纸条插入用稀释液稀释好的标本中后，胶体金结合物与标本一起移动，当移动至硝酸纤维膜上的抗轮状病毒多抗时，如果标本中含有轮状病毒，则胶体金-轮状病毒结合物会与抗轮状病毒多抗结合，5-10分钟出现红色的检测线。多余胶体金结合物继续移动，将与包被在膜上的羊抗鼠IgG抗体结合，形成另外一条红色的对照线。胶体金免疫层析法原理02具体方法是提取适量的患者粪便放入到试管内，加入9倍的生理盐水后均匀搅拌，在静止后或者低速离心以后，在加样处另外滴加3-4滴粪便上清液，在室温情况下，10min以后进行辨别分析。如果测试卡显示的是两条红线，即可判断属于阳性，如果只仅仅出现一条对照线，则阴性，若没有出现对照线，说明检测结果无效，必须重新进行检测。轮状病毒初筛03轮状病毒确诊04轮状病毒的确诊采用real-timeRT-PCR作为确诊方法。方法原理：，取待测样品，加入匀浆缓冲液研磨，通过温育促进病毒粒子释放，利用PEG8000使病毒沉降，采用纳米磁珠直接从PEG8000沉降后的病毒悬液中富集病毒粒子，吸附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解，释放出病毒RNA，无需进一步纯化，直接实时荧光RT-PCR方法进行检测。real-timeRT-PCR检验流程图取蛋花样便5mL离心取1mL上清液+0.14mL16%PEG80004℃，10000g，离心10minreal-timeRT-PCR转移上清液（RNA）到无Rnase的离心管加入50μL核酸释放液，95℃，5min磁力吸附纳米磁珠1min~5min，弃上清液加入50μL纳米磁珠，混匀1mL结合缓冲液重悬沉淀冰上放置1h报告结果4℃，10000g，离心10min室温放置5min~15min4℃，10000g，离心10min荧光PCR结果的判定1、对照结果ａ）阳性对照：有荧光增幅现象；ｂ）阴性对照：无荧光增幅现象；ｃ）空白对照：无荧光增幅现象；ｄ）否则，实验视为无效2、检测结果判定A、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品无荧光增幅现象，则判断样品中未检出Ａ群轮状病毒。B、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤

35时，则判断样品中检出Ａ群轮状病毒。C、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的