第五章色谱分离法新

第五章色谱分离法新第1页，课件共97页，创作于2023年2月吸附色谱排阻色谱（凝胶色谱）分配色谱离子交换色谱吸附能力的差异分子尺寸的大小不同两相中分配系数的不同亲和力的差异AdsorptionchromatographyExclusionchromatographyGel-permeationchromatographyPartitionchromatographyIon-exchangechromatography色谱分离法的分类（原理）第2页，课件共97页，创作于2023年2月§5－1纸色谱法纸色谱法：以滤纸吸附的水作固定相，有机溶剂作流动相的一种色谱法。第3页，课件共97页，创作于2023年2月§5－1纸色谱法一、基本原理和特点二、定性分析三、操作技术四、应用第4页，课件共97页，创作于2023年2月一、基本原理和特点基本原理：它和萃取一样，它也是根据不同物质在两相间的分配比不同而进行分离的（相当于逆流萃取）特点：操作简单、分离效率高，但分离速度慢。第5页，课件共97页，创作于2023年2月1.层析缸123456732.滤纸3.原点4.展开剂5.前沿6.7.斑点第6页，课件共97页，创作于2023年2月二、定性分析

组分分离后，它们在滤纸上的位置用比移值来表示，它也是色谱定性分析的依据。aABbl

将标准和样品的Rf值进行比较，可以对样品进行定性分析。定性分析方法：第7页，课件共97页，创作于2023年2月二、定性分析影响比移值的因素：1）欲分离物的本性:物质在两相的分配系数,决定了它的Rf大小2)层析溶剂:同一组分在不同溶剂中Rf不同。通常应选这样的层析剂，使溶质的Rf在0.050.85之间,不同组分的Rf差值>0.05.3）pH:影响它们的存在状态第8页，课件共97页，创作于2023年2月二、定性分析4）滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质5）温度:温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在恒温下进行，温度不超过±0.5oC6）展开方式:展开方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大，上行法的Rf较小，环行法的Rf也不大。第9页，课件共97页，创作于2023年2月三、操作技术1.滤纸的选择和处理2.固定相的选择3.试样的制备和点样4.展开5.显色第10页，课件共97页，创作于2023年2月1.滤纸的选择与处理滤纸的选择：

a.要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐

b.要求滤纸的纤维松紧适宜

c.滤纸的杂质含量少

以0.1～0.4mol/LHCl(或2mol/LHAc)浸泡数小时,除去无机杂质后,取出用蒸馏水洗净,再将滤纸放在丙酮-乙醇(1:1)中浸泡一周时间,除去有机杂质,再取出风干备用.滤纸的处理第11页，课件共97页，创作于2023年2月2.固定相的选择

纸层析——以吸着在纤维素上的水作固定相。反相纸层析——用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定相。第12页，课件共97页，创作于2023年2月3.试样的制备和点样A.试样的制备

固体试样尽量不用水来溶解，而多采用乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂来溶解，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。液体试样可直接点样。

ⅰ）先用铅笔在距纸条一端2~3cm处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；见下示意图：B.点样方法第13页，课件共97页，创作于2023年2月3.试样的制备和点样第14页，课件共97页，创作于2023年2月3.试样的制备和点样ⅱ）点样工具：微量注射器、毛细滴管（Φ＝0.5mm)

；ⅲ）点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，使点样的斑点直径为0.2~0.5cm,每次点样2~20μL于滤纸上，以冷风吹干；ⅳ）干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。第15页，课件共97页，创作于2023年2月4.展开欲分离物在两相中的溶解度；展开剂的极性展开剂与欲分离物间应无化学反应欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到A.展开剂的选择第16页，课件共97页，创作于2023年2月4.展开B.展开方法

展开前，层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。展开方式可分为上行法、下行法和环行法及双向展开法等。第17页，课件共97页，创作于2023年2月4.展开B.展开方法（上行法）将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂（但不能浸没点样处）上端固定在层析缸的上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端3~4cm时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号（见右图）第18页，课件共97页，创作于2023年2月4.展开B.展开方法（下行法）

溶剂自纸的上端向下降（借助于重力的作用），具有分离速度快及连续挥发色谱的优点。玻皿玻片玻璃棒原点剪成锯齿状，便于溶剂滴下第19页，课件共97页，创作于2023年2月4.展开B.展开方法（环行法）取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。第20页，课件共97页，创作于2023年2月4.展开B.展开方法（双向展开法）

有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。第21页，课件共97页，创作于2023年2月4.显色a.有色物：直接观察各个色斑无色物：物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂。如若被分离的物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。第22页，课件共97页，创作于2023年2月四、应用例１．氨基酸的分离（固定相为水）流动相分离情况正丁醇：2mol/LHAc=1:1酪氨酸、二碘酪氨酸用水饱和的苄醇亮氨酸、异亮氨酸叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水＝16:16:0.1:3.9亮氨酸、异亮氨酸第23页，课件共97页，创作于2023年2月四、应用例2.糖的分离(固定相为水)流动相分离情况醋酸乙脂:吡啶:水=2:1:1木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖丁醇:吡啶:水=45:25:40乳糖、半乳糖、葡萄糖丁醇:乙醇:水:NH3=40:10:49:1尿中葡萄糖丁醇:乙醇:水=10:1:2蜜二糖、果糖、葡萄糖、第24页，课件共97页，创作于2023年2月四、应用例３．脂肪酸的分离（固定相为水）流动相分离情况95%乙醇：浓氨水＝100:1同系的直链脂肪酸正己醇：1.5mol/L氨水＝1:1烷氧基酸流动相1:乙醇：浓氨水:H2O=80:5:15流动相2：乙二醇乙醚：桉树脑：88%甲酸=5:5:2草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、羟基醋酸、顺丁烯二酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、乌头酸、己二酸、延胡索酸、葵二酸第25页，课件共97页，创作于2023年2月四、应用例4.醇、酚的分离（固定相为水）流动相分离情况丁醇：5%NaHCO3＝1:1甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、辛醇己烷饱和甲醇乙醇、异丙醇、丙醇、异丁醇、正丁醇丁醇：乙醇：水＝4:1.1:1.9乙二醇、丙三醇、甘露糖醇、山梨醇、肌醇第26页，课件共97页，创作于2023年2月四、应用流动相分离情况正丁醇：浓氨水：水＝4:1:5磺胺嘧啶、磺胺噻睉、Sulfamerzine、p,p’-sulfonyldianiline正丁醇：醋酸：水＝4:1:5对胺基苯甲酸、维生素C、N－甲基－菸酰胺、菸碱酰胺、菸酸、潘妥宁、泛酸、VB6、VB1甲苯：石油醚：乙醇：水＝200:100:30:70雌酮、雌二酮、雌三酮、马烯雌酮、脱氢皮质甾酮酸、孕甾酮、顺式睾丸甾酮例5.其它类的分离（固定相为水）第27页，课件共97页，创作于2023年2月四、应用例6．无机应用（固定相为水）流动相分离情况12mol/LHCl:甲醇:丁醇:甲基异丁酮＝55:35:5:5K+、Rb+

、Cs+乙醇：水＝80:20Li+

、Na+

、K+10%HCl的水饱和丁醇Zn2+－Ga3+－In3+

－Al3+苯酚:甲醇:HCl＝5:3:2Al3+－Ga3+－In3+－Tl3+第28页，课件共97页，创作于2023年2月四、应用例7．生物学应用黑毛红毛黄毛白毛

取不同颜色兔毛(300~500mg),干法灰化,溶于稀HCl中,用丙酮:丁醇:HCl=10:4:2,展开后,显色第29页，课件共97页，创作于2023年2月Exercise1用纸色谱分离混合物中物质A和B，已知两者的比移值分别为0.50和0.60，问欲使层析后斑点显著分开，斑点间至少间隔1cm，问滤纸应截取多长？

设前沿为l，原点到A、B斑点中心距离分别为a、b，两斑点间至少间隔1cm，那么两斑点中心相距为2.0cm，则可列出：解：原点应距滤纸下端4cm，前沿应距滤纸上端2-3cm，应截取滤纸长20+4+2=26cm,滤纸条应截取26-27cm长。第30页，课件共97页，创作于2023年2月Exercise2纸色谱法分离混合离子,若混合离子极性大小顺序为A>B>C,用弱极性有机溶剂展开后其Rf值大小顺序为______________________。

C,B,A第31页，课件共97页，创作于2023年2月§5－2薄层色谱法（TLC）一、基本原理和特点二、吸附剂三、操作技术四、应用第32页，课件共97页，创作于2023年2月一、基本原理和特点[原理]:经典的薄层色谱是以吸附剂为固定相的一种液相色谱法，利用试样组分在流动相（展开剂）和固定相（吸附剂）之间反复吸附、溶解而分离。

实际上，薄层色谱的固定相不仅仅局限于吸附剂，也可以在铺好的惰性薄层上均匀地再涂一种作为固定液的液体，进行分配分离。第33页，课件共97页，创作于2023年2月一、基本原理和特点[特点]:

装置简单、操作方便展开时间短（10～60min）灵敏度高：可以检出0.01μg

显色方法多于纸色谱[缺点］：Rf值的重复性差定性分析：Rf定量分析：光度法或荧光法第34页，课件共97页，创作于2023年2月二、吸附剂［要求］：合适的吸附力与展开剂、被吸附物质均不起化学反应粒度细小而且均匀

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶。此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附剂。根据范氏方程，减少涡流扩散项第35页，课件共97页，创作于2023年2月1.氧化铝

氧化铝可分为中性、碱性和酸性三种，一般常用碱性氧化铝。通常用于分离碳氢化合物、生物碱类和对碱性物质比较稳定的中性和碱性物质。酸性化合物可用酸性氧化铝分离。

氧化铝的活性与含水量密切相关（含一定量的水份时，吸附剂表面的吸附中心会被水分子占据）第36页，课件共97页，创作于2023年2月1.氧化铝活性Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

Ⅴ含水量(％)０３６１０１５Δ100~150oC,除去Al2O3中与羟基结合的部分水份，使Al2O3有一定的活性Δ150~300oC，

Al2O3活性达Ⅱ～Ⅲ级Δ300~400oC，Al2O3活性达Ⅰ

～Ⅱ级Δ>600oC，Al2O3进一步脱水并开始烧结一般要求薄板用的活性为Ⅱ~Ⅲ级第37页，课件共97页，创作于2023年2月

由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，每批生产的Al2O3

，其表面积和表面孔穴结构并不一致，活性也不相同。

Al2O3活性的测定：取20µL染料溶液（偶氮苯30mg、对－甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各20mg，溶解于50mLCCl4中），加到薄板上，用CCl4展层，根据下表确定活性。第38页，课件共97页，创作于2023年2月活性ⅡⅢⅣⅤRf,偶氮苯0.590.740.850.95Rf,对-甲氧基偶氮苯0.160.490.690.89Rf,苏丹黄0.010.250.570.78Rf,苏丹红0.000.100.330.56Rf,偶氮苯0.000.030.080.19Al2O3活性表第39页，课件共97页，创作于2023年2月市售的供薄层色谱用的Al2O3有:Al2O3

－H氧化铝中无粘合剂Al2O3

－G氧化铝中含煅石膏（一般5％煅石膏）［煅石膏CaSO4，作为粘合剂］Al2O3

－HF254氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指示剂（在254nm下呈黄绿色荧光）Al2O3

－GF254氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示剂（在254nm下呈黄绿色荧光）上述商品可以直接调料涂敷（1份料，2份水调合）第40页，课件共97页，创作于2023年2月2.硅胶

硅胶是微酸性吸附剂，适用于酸性、中性物质的分离（如有机酸、氨基酸、萜类、甾类），碱性物质则能与硅胶作用（当用中性溶剂展层，碱性物质有时停留在原点不动，或者得到拖尾的斑点，而不能很好的分离）活性ⅠⅡ

ⅢⅣⅤ含水量（％）05152535注硅胶薄层的活化温度不能高于200oC第41页，课件共97页，创作于2023年2月

硅胶活性的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各40mg溶于100mL苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开10cm，混合物应不动；如用苯展开，则应分成三个斑点，其Rf值分别为：二甲黄0.58，苏丹红0.19，靛酚蓝0.08（展层时间30~45min），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与Al2O3活性Ⅱ~Ⅲ级相当。

薄层用商品硅胶有：硅胶H（不含粘结剂）、硅胶G（含粘结剂煅石膏）、硅胶HF254（含荧光物质的硅胶）硅胶GF254（含有煅石膏和荧光剂）第42页，课件共97页，创作于2023年2月3.吸附剂的选择1）根据样品组分的性质亲脂性选择硅胶、氧化铝、乙酰化纤维素、聚酰胺等亲水性选择离子交换纤维素、硅藻土等酸性物质首选硅胶板，碱性物质首选氧化铝板极性很大的物质解吸难时可用聚酰胺（如酚）2）根据吸附剂的性质适宜活性：活性大，易脱尾；活性小，不能分离考虑吸附剂对样品的作用：如碱性氧化铝对酯的水解起催化作用。第43页，课件共97页，创作于2023年2月三、操作技术1.薄层板的制备2.样品溶液的配制3.点样4.展开5.显色6.定性定量分析7.常见问题及消除方法第44页，课件共97页，创作于2023年2月1.薄层板的制备

玻璃板

a.平整、去油、去污（可用浓H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自来水洗净后，烘干）

b.玻璃板的尺寸根据自己的需要自由选择，小的可用2.57.5cm的载玻片,大的可用2020cm的玻片。

涂铺液

取一定量的吸附剂放入研钵中，加入需要的水或适当的溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，当浓度均一后，即成胶状物，色泽洁白为最佳，立即倾入玻璃板上，用下述方法涂布。第45页，课件共97页，创作于2023年2月1.薄层板的制备

涂布方法

软板的制备：干法铺层。

硬板的制备：湿法铺板。方法有倾注法，平铺法和涂铺器法三种。目前广为应用的是涂铺器法，操作简便，薄板厚度均匀，适合于定量分析。第46页，课件共97页，创作于2023年2月1.薄层板的制备

活化

薄板首先风干，否则湿板一下加热到高温，烘出的薄板很酥松，使用效果不好。

氧化铝G板在150~160oC,烘4小时(Ⅱ级左右)

硅胶G板在110oC烘1小时薄板经活化后，一定要储藏在密闭的干燥器或烘箱中备用。第47页，课件共97页，创作于2023年2月2.样品溶液的制备

首先将固体样品粉碎过筛：疏松的粉末过40目筛，坚实的粉末过80目筛

用适宜的方法和溶剂提取样品组分：其提取方法包括索式提取器提取法、冷浸法、热回流法、振摇提取法、超声提取法。

样品溶液的精制（除去杂质）：溶剂萃取或柱色谱法

溶液的蒸发与残渣的溶解（对溶液浓缩）：（常用旋转蒸发仪、KD浓缩器、水浴蒸发等）第48页，课件共97页，创作于2023年2月旋转蒸发仪KD浓缩器第49页，课件共97页，创作于2023年2月3.点样

点样方法类似于纸色谱

点样量一般1~10μL。点样器有微量注射器，容量毛细管和精密的自动或半自动点样仪点样的形状一般为圆点，直径小于3mm切勿损伤薄层表面第50页，课件共97页，创作于2023年2月4.展开1）对展开剂的要求※

能够溶解待测组分※

能使待测组分与杂质分开※

使待测组分的Rf值在0.2~0.8之间，定量测定最好在0.3~0.5之间。※

不能与待测组分或吸附剂发生化学反应※

具有适中的沸点和比较小的粘度※

混合溶剂最好临用前新鲜配制。第51页，课件共97页，创作于2023年2月2）展开剂的性质A极性：单一溶剂的极性顺序是：石油醚<环己烷<二硫化碳<苯<四氯化碳<三氯乙烯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水

混合溶剂的极性参数P’=δAPA＋δBPB（δA是体积分数）B强度在吸附色谱中，用εo表示，指溶剂在单位表面积的标定活性的吸附剂上的吸附能。分配色谱与极性参数有关。第52页，课件共97页，创作于2023年2月C展开剂的选择性组别溶剂名称Ⅰ脂肪族醚，三级烷胺，四甲基胍，六甲基磷酰胺Ⅱ脂肪醇Ⅲ吡啶，四氢呋喃，酰胺（除甲酰胺），乙二醇醚，亚砜Ⅳ乙二醇，苯甲醇，甲酰胺，乙酸Ⅴ二氯甲烷，二氯乙烷Ⅵa磷酸三甲苯酯，脂肪族酮和酯，聚醚，二氧六环Ⅵb腈，砜，碳酸丙烯酯Ⅶ硝基化合物，芳香醚，芳烃，卤代芳烃Ⅷ氟烷醇，间甲苯酚，氯仿，水

根据溶剂分子与样品分子间的四种作用力，将溶剂分为八组。第53页，课件共97页，创作于2023年2月3）展开剂的选择A总原则：

先用一展开剂，它的极性或强度能够使容量因子k最好在0.5~5之间（或Rf值在0.2~0.6)，然后保持此强度不变，然后根据溶剂的选择性再更换其他的展开剂，直到使待测组分很好分离。B二元展开剂的选择由一个强度较强的溶剂和一个强度近于零的溶剂（强度调节剂）混合并计算其强度。正相TLC多用正己烷为强度调节剂，反相TLC则使用水。第54页，课件共97页，创作于2023年2月3）展开剂的选择C多元展开剂的选择Glajch提出了确定溶剂强度和选择性的最优化三角形法.

做法如下：先选三种选择性相差大的纯溶剂，再选一种调节极性的纯溶剂组成三个相等洗脱强度的二元基本溶剂A,B,C.BACDEFGHIJ

然后再分别配成A:B:C=0.5:0.5:0,(D)0.5:0:0.5(E),0:0.5:0.5(F)和0.33:0.33:0.33(G),0.67:0.16:0.16(H)0.16:0.16:0.67(I),0.16:0.67:0.16(J)的几种混合溶剂。第55页，课件共97页，创作于2023年2月以正相TLC法为例：1）先选择溶剂选择性相差较大的三种溶剂：乙醚(Ⅰ)、氯仿(Ⅷ)和二氯甲烷(Ⅴ)。选正己烷为极性调节剂。2)用氯仿-正己烷的不同比例在硅胶板上分离样品，发现用氯仿：正己烷＝34：66的组成比例可使斑点(待测组分)的Rf在0.3~0.5之间，算出极性参数：P’=4.1×0.34+0.1×0.66=1.46。保持P’不变，计算出其他两个二元溶剂的体积比。二氯甲烷：正己烷＝45：55，乙醚：正己烷＝50：50。3)再根据Glajch三角形图，确定其他七种多元体系的体积比。第56页，课件共97页，创作于2023年2月4）展开方式TLC的展开方式类似于纸色谱。矮型色谱缸内一般用近水平上行展开，不加粘合剂的板层也适合在此展开；直立上行一般在长方筒形或双底槽色谱缸中进行，这种展开只适合含有粘合剂的薄层。第57页，课件共97页，创作于2023年2月5.显色1）光学检出法本身是有色物，可以直接观测斑点的位置和颜色本身无色但在紫外线的照射下会发出不同颜色的荧光在可见光和紫外光下都不显示，也没有合适的显色方法，可以用荧光薄板(硅胶HF254+366,硅胶GF254,...)进行分离,欲测物吸收紫外线,在荧光背景下呈暗色第58页，课件共97页，创作于2023年2月5.显色3）生物自显影

对于抗菌素等具有生物活性的物质，将分离后的薄层与具有适当微生物的琼脂培养基表面接触，经过培养后观察抑菌点。4）放射自显影

在薄层上分离的放射性同位素的辐射线，可使照相底片感光，照片所呈暗度与斑点的放射活性成正比，因此，得到的放射显迹图可以定性和定量。2)蒸气显色法利用一些物质的蒸气与样品作用生成不同颜色或产生荧光。如多数有机物吸附碘蒸气显示黄色斑点。第59页，课件共97页，创作于2023年2月5.显色5）试剂显色法

薄层色谱中显色最多的方法是光学检出法和试剂显色法

展开后的薄层根据待测化合物的性质选择适当的显色剂使之生成颜色稳定、轮廓清晰、灵敏度高的色斑。由于对薄层板的处理方式不同，试剂显色法又分为喷雾显色和浸渍显色两种。不加粘合剂的薄板禁用

有些显色反应需要加热，一般在恒温烤箱内进行，温度控制在100~110℃。第60页，课件共97页，创作于2023年2月表主要显色试剂试剂配制及使用方法检出范围浓H2SO4喷雾,100~120oC,观察颜色变化高级醇、醛、酮、甾体H2SO4-K2Cr2O75gK2Cr2O7+100mLH2SO4,喷雾,280oC观察颜色变化全部有机物2’,7’-二氯荧光黄(0.2%乙醇)喷雾，紫外线照射类脂类化合物I2-KI1gI2+10gKI溶于50mLH2O中，加入2mLHAc，稀释至100mL，喷雾生物碱第61页，课件共97页，创作于2023年2月试剂配制及使用方法检出范围溴甲酚绿0.04g溶于100mL乙醇中，以0.1mol/LNaOH调至蓝色刚消失，<pH3.6显黄色羧基酸Ag(NH3)2+2.6gAgNO3溶于50mL水，加入NH3H2O至沉淀刚好消失还原性物质、醛、还原糖茚三酮0.5%丙酮溶液胺类（如麻黄碱、氨基酸等）FeCl31g溶于100mL酚羟基、鞣质、黄酮磷钼酸5g溶于100mL95%乙醇脂肪、甾类、类脂、三萜酸、生物碱续表主要显色试剂第62页，课件共97页，创作于2023年2月6.定性定量分析1）定性分析

比移值定性：标准物质对照。

光谱定性：薄层扫描仪

各种联用检测仪器联用：将斑点吸附转移到试管中，用其他方法纯化，然后进行紫外、荧光、红外等光谱法定性。第63页，课件共97页，创作于2023年2月6.定性定量分析2）定量分析

目视比较半定量法：杂质的限量实验。测量斑点面积：要求斑点边缘清晰从薄层上将被测组分洗脱下来进行定量测定：先确定斑点，再取下斑点和吸附剂，最后用适当的洗脱剂洗脱分析物，进行测定薄层色谱扫描仪原位定量测定：紫外－可见吸收测定或荧光测定法。第64页，课件共97页，创作于2023年2月7.常见问题及消除办法1）斑点拖尾现象▲酸性物质用中性溶剂展开时，造成拖尾。（在展开剂中加入一定浓度的酸）。碱性物质类似。▲在碱性氧化铝薄层上分离酸性物质，或在硅胶G板上分离生物碱，由于成盐而造成拖尾。（禁止此类操作）▲点样量过多造成拖尾（减少点样量）第65页，课件共97页，创作于2023年2月7.常见问题及消除办法3）边缘效应

板层中部斑点的Rf值小于两侧斑点的Rf值，这是因为沸点较低的和与吸附剂亲和力弱的溶剂在薄层的两个边缘处较易挥发（用刀片刮去同样宽度的边或增加板层的预饱和时间）2）S形及波浪形斑点

主要由于吸附剂的颗粒细度和板层厚度不均匀造成（铺板时要注意这个问题）第66页，课件共97页，创作于2023年2月7.常见问题及消除办法5）Rf值不稳定

温度、分配系数、展开剂的挥发、板层厚度和不同批号的薄层板都影响Rf值。注意逐一分析。4）展速慢

加入丙酮等中等极性溶剂可使不相混合的溶剂混合，加快展速。第67页，课件共97页，创作于2023年2月四、应用1.氨基酸分离薄层:硅胶G板;流动相:

正丁醇:醋酸:水=3:1:1Rf值:丙氨酸0.27,氨基辛酸0.60,精氨酸盐酸盐0.08,磺基丙氨酸0.14,胱氨酸盐酸盐0.16,二羟基苯丙氨酸0.45,

甘氨酸0.22,组氨酸盐酸盐0.06,羟脯氨酸0.20,亮氨酸0.47,甲硫氨酸0.40,颉氨酸0.36,

苯丙氨酸0.49,脯氨酸0.19,肌氨酸0.17,苏氨酸0.25,色氨酸0.56第68页，课件共97页，创作于2023年2月2.核苷,核苷酸,寡核苷酸的分离薄层:硅胶F254

流动相:正丁醇:HAc:H2O=5:2:3Rf值:腺苷-5`-磷酸0.35,胞苷-5`-磷酸0.24,脱氧腺苷-5`-磷酸三氯乙酯0.74,脱氧胸苷酰(3`,5`)脱氧胸腺嘧啶核苷0.61,5-甲基尿苷-5`-磷酸酯(胸苷-5`-磷酸)0.37,5`-0-磷酸基脱氧胸腺嘧啶核苷酰-(3`5`)脱氧胸腺苷酰-(3,5)脱氧胸苷0.19,5`-0-三氯乙基-磷酸脱氧腺苷酰(3`,5)脱氧腺苷0.68,尿苷-5`-磷酸0.30四、应用第69页，课件共97页，创作于2023年2月3.类固醇、固醇的分离薄层：Al2O3

流动相：C6H6:乙酸乙酯=4:1Rf值:胆甾醇0.83,别色胆甾醇0.77,-谷甾醇0.63,豆甾醇0.62,-谷甾烷醇0.444.碱金属的分离薄层:硅胶卷流动相：含0.1mol/LI2

的硝基甲烷:C6H6=40:60Rf值:Cs+0.55,Rb+0.47,K+0.36,NH4+0.24,Na+0.18,Li+0.06四、应用第70页，课件共97页，创作于2023年2月§5－3凝胶色谱法一、基本原理和特点二、凝胶的种类和性质三、操作技术四、应用第71页，课件共97页，创作于2023年2月一、基本原理和特点

1.原理：按溶质分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。所以凝胶色谱又称为排阻色谱。它的分离机理与其他色谱完全不同，它不是依靠溶质在两相间的作用力不同而分离的。

第72页，课件共97页，创作于2023年2月2.特点：◎全部在死体积前出峰。所以保留时间短，柱内峰扩展就比其他分离方法小很多，所以峰通常比较窄，有利于检测。

◎分离对象范围宽。可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离

◎

固定相和流动相选择方便，根据流动相不同，分为两类：以水溶液作流动相的叫做凝胶过滤色谱，分离溶于水的物质；以有机溶剂为流动相的叫做凝胶渗透色谱，分离不溶于水的物质。◎

只能分离相对分子质量相差10％以上的分子，不能分离分子量接近、分子大小相似的分子。一、基本原理和特点第73页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质

1.凝胶的种类所谓凝胶，是含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。

♥根据凝胶的来源分类，凝胶可分为无机凝胶和有机凝胶两类。

♥根据凝胶的制备方法可分为均匀凝胶、半均匀凝胶和非均匀凝胶。

♥根据凝胶使用的强度可分为软质凝胶、半硬质凝胶、硬质凝胶。

♥根据凝胶对溶剂的适用范围，凝胶可分为亲水性、亲油性和两性凝胶。第74页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质①多孔硅胶

是使用较多的无机凝胶，它的特点是稳定性好、机械强度好，可在柱中直接更换溶剂。缺点是吸附问题，需要经特殊处理。一般表面未处理硅胶可用于水、酸体系，但不能用于强碱性溶剂；表面硅烷化的硅胶可用于有机溶剂。由于多孔硅胶的机械强度高，因此在交联聚苯乙烯凝胶后，细粒度的多孔硅胶已经发展成为一种很好的高速、高效凝胶色谱填料。其中以μBondagel更有特色，能成功分离水中的生化体系。第75页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质②

交联聚苯乙烯凝胶

商品名叫Styrogel，这种凝胶孔径分布比较宽，因此分子量分离范围比较大，可分离分子量从1600到40000000的生物大分子。主要使用非极性溶剂，丙酮、乙醇等极性溶剂不能应用，且不能在柱中直接更换溶剂。最高使用温度为150℃，一般装完柱后不再拆下来。洗脱剂可用甲基亚砜。适用于有机多聚物、分子量测定和脂溶性天然物的分离。第76页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质③交联葡聚糖凝胶

商品名叫Sephadex，是最早发展的有机凝胶。主要有sephadexG型和SephadexLH－20型。

SephadexG型的凝胶在字母G后面用阿拉伯数字表示得水值的10倍。如G－25表示每克凝胶膨胀时吸水2.5克。目前主要有G－10，15，25，50，75，100，150，200等型。主要应用于生物高分子如蛋白质、核酸、酶以及多糖类的分离，生化体系的脱盐等。

SephadexLH－20型是sephadexG－25的羧丙基衍生物，属于两性凝胶，可用于分离不溶于水的物质。第77页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质④交联聚丙烯酰胺凝胶

是丙烯酰胺和次甲基双丙烯酰胺的共聚物，其商品名为Bio-GelP，型号有P－2,4,6,10,30,60,100,150,200，300等10种。P后面的数字乘以1000就是凝胶的排阻限度。这类凝胶的优点是孔径尺寸范围较宽，所以分离范围大。如Bio－GelP－300分离分子的分子量范围可从60000～400000。骨架没有离子基团，因而吸附效应小。不溶于水、盐溶液和普通有机溶剂。其最大弱点是不耐酸，遇酸时酰胺键易水解产生羧基，带上一定量的离子交换基团，一般在pH2～11范围内比较稳定。第78页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质⑤琼脂糖凝胶

是全天然凝胶，商品名较多。如Sepharose（瑞典pharmacia），Bio－Gel－A（美国Bio－Rad）等。它是琼脂经过分级沉淀除去了带电荷的琼脂胶，留下了不带电荷的琼脂糖的产品，然后在油相中分散成球。它是用来分离高分子量物质的凝胶，渗透极限极高，分离范围的下限相当于前两种凝胶的上限。因而琼脂糖凝胶使得分离一些分子量极高的物质如病毒成为可能。琼脂糖凝胶在高温下不稳定，在40℃以上就开始熔解。要避免如脲素溶液等破坏氢键结构的淋洗剂。要用化学灭菌的方式杀菌，避免堵塞柱子。第79页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质

2.凝胶的性质凝胶的性质分为凝胶的结构参数和色谱指标两类。凝胶的结构参数一般有粒度、比表面积、孔体积、堆比重（指紧密堆积每毫升凝胶的重量）、骨架密度、孔度（孔的体积占多孔性物质总体积的分数）、平均孔径和孔径分布等。凝胶的色谱指标主要有渗透极限、分离范围、固流相比和柱效四个。第80页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质①渗透极限

指凝胶可以用来分离高分子的最大极限。超过这个极限，高分子都在凝胶粒间隙体积V0处流出，没有分离效果。②分离范围

一般是指分子量－淋出体积标定曲线的线性部分。孔径分布宽的凝胶分离范围大。实际应用时可以用不同规格的凝胶串联起来。第81页，课件共97页，创作于2023年2月二、凝胶的种类和性质③固流相比

指固定相的体积（指色谱柱内凝胶的全部可渗透的孔内体积）比上流动相的体积（凝胶的粒间隙体积），它反映了色谱柱的分离容量。分离容量越大越好。④柱效是凝胶分离效率的量度。可用实验方法测定，让一个小分子试样流经长度L的柱子，得到色谱峰（Ve是淋出体积，W是峰宽），则单位柱长的柱效为：第82页，课件共97页，创作于2023年2月三、操作技术1.层析柱的选择

层析柱是凝胶分离的主体，一般使用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径不影响分离度，样品用量大可选择直径大的柱。分离度与柱长的平方根成正比，但由于软质凝胶柱过高易造成挤压变形从而堵塞柱子，所以一般不超过1m。分族分离柱长一般20～30cm，柱高与柱直径之比一般在5：1～10：1之间，而分级分离柱长一般为50～100cm，柱高与柱直径之比一般在20：1～100：1之间。第83页，课件共97页，创作于2023年2月三、操作技术2.凝胶的选择

凝胶的选择主要考虑两点：Ⅰ）凝胶和溶剂的匹配Ⅱ）凝胶的孔径及其分布与被测试样分子体积范围的匹配。由于目前凝胶种类繁多，所以选择和流动相相匹配的凝胶并不难，只要求能被流动相溶解即可，而对于凝胶的孔径和分布的选择，一般需作标定曲线，找出凝胶的选择性渗透的范围，再根据分子的体积范围进行选择。第84页，课件共97页，创作于2023年2月三、操作技术3.凝胶的制备

商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要在欲分离的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法。即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温，这样可以大大加速膨胀，通常在1～2h之内即可完成。特别在使用软凝胶时，自然膨胀需24h甚至数天，而加热法在几小时内即可完成。而且使用加热法还可消毒，并除去凝胶中污染的细菌和空气。第85页，课件共97页，创作于2023年2月三、操作技术4.装柱

装柱的基本原则是：色谱柱应填得尽可能均匀和紧密，在柱中没有裂缝或沟槽，也不发生柱的径向或轴向凝胶的不均匀分布。色谱柱的装填可以分为干法和浆法装柱两种。粒度较大的硬胶和多孔硅胶及多孔玻璃可以用干法装柱；浆法装柱首先需要寻找与凝胶密度相同的混合溶剂，这样才不会发生粒度分层。第86页，课件共97页，创作于2023年2月三、操作技术5.溶剂的选择

①溶剂应与凝胶色谱仪匹配：首先考虑色谱仪材料能否忍受的问题，如腐蚀不锈钢的溶剂不能选。另外，溶剂还应与检测器匹配，如使用示差折光检测器，那么溶剂的折光指数应与被测试样的折光指数有尽可能大的差别。

②尽可能使用纯度