第二章基因工程基本技术原理DNA序列分析

第二章基因工程基本技术原理DNA序列分析第1页，课件共29页，创作于2023年2月目的与要求掌握DNA测序的一般原理和方法，通过学习，分析DNA策序与蛋白质策序的区别。重点：

Sanger双脱氧链终止法策序原理和方法难点：如何根据凝胶电泳直接读出DNA序列学时：2学时学习方法：课堂讲授与讨论相结合第2页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.1Sanger双脱氧链终止法■

2.5.2Maxam－Gilbert化学修饰法■

2.5.3序列分析自动化■2.5.4杂交测序■2.5.5DNA策序的商业运作及存在问题■2.5.6思考问题■第3页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.1Sanger双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。返回DNA核酸序列分析历程第4页，课件共29页，创作于2023年2月引物—延伸测序策略1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．RayWu）独创性地设计出一种崭新的引物延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。第5页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.1.1Sanger双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’，3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。也称引物合成法，或酶催引物合成法。第6页，课件共29页，创作于2023年2月反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及四种dNTP（有一种带放射性标记）。变性胶电泳分离反应混合物。放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。第7页，课件共29页，创作于2023年2月GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC考考你第8页，课件共29页，创作于2023年2月酶、原料比例dNTP／ddNTP=100：1时，谱带分离效果较佳，可读出多于200个以上的核苷酸顺序。降低dNTP对ddNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到能判读出300个左右的核苷酸顺序。第9页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.1.2Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷分析：这样处理后，能策得高分子量DNA吗？为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。费时、费力、费钱、DNA损伤严重第10页，课件共29页，创作于2023年2月克服缺点的一种途径—DNA分子克隆将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链DNA噬菌体，例如M13作为载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物”。第11页，课件共29页，创作于2023年2月M13载体克隆DNA片段将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑;非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。第12页，课件共29页，创作于2023年2月这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。第13页，课件共29页，创作于2023年2月使用M13载体系列的优点所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样，就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种最普遍采用的快速的DNA序列分析法。第14页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.1.3Sanger双脱氧—pUC体系DNA序列分析法将待测DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作DNA序列分析。这种方法特称为利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列，所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列分析法。第15页，课件共29页，创作于2023年2月Sanger双脱氧—pUC体系DNA序列分析法基本步骤待测DNA与pBR322或pUC分子重组；转化：转化反应物涂布在补加有Xgal-IPTG选择性培养基平板上，经37℃过夜培养；挑选白色菌落，制备质粒NA。碱变性处理，与引物一起退火，然后按双脱氧法作序列分析。优点：无需将DNA克隆到M13载体上，更为简单快速，现已被许多研究工作者采用。返回目录第16页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.2Maxam－Gilbert化学修饰法是1977年由美国哈佛大学的A．M．Maxam和W．Gilbert

发明的，所以又叫做Maxam－GilbertDNA序列分析法虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言，化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中仍被采用。第17页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.2.1Maxam－Gilbert化学修饰法的原理化学试剂处理末端标记DNA片段，碱基的特异性切割产生的DNA片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。第18页，课件共29页，创作于2023年2月出发材料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端带有放射性标记的DNA片段(双链或单链）关键：4种核苷酸碱基中，有1～2种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要内容。第19页，课件共29页，创作于2023年2月碱基特异的化学切割反应——肼（NH2·NH2）肼能够从C4或C6位置作用于T和C，并用C4-C5-C6环化形成一种新环;进一步作用释放出吡唑琳酮环，留下的N1－C2－N3片段则仍连在糖环上。在具有六氢吡啶的条件下，通过β-消除反应，2个磷酸分子从糖片段上释放出来，从而导致DNA链断裂。反应体系中加入lmol/L浓度的盐，肼同T的反应速率便会逐渐下降，以确保发生C特异的化学切割反应。根据这一特点区别C和C+T之间的降解产物。第20页，课件共29页，创作于2023年2月碱基特异的化学切割反应——硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］在硫酸二甲酯的作用下，碱基环中的氮原子发生甲基化反应（G

N7和A

N3）。中性PH：甲基化导致配糖键水解，留下失去碱基的糖一磷酸骨架上的键。这种键十分微弱，易于使糖片段两翼的磷酸脱落，造成DNA断裂;碱性pH：采用六氢吡啶同DNA甲基化反应，而这种反应对甲基化的G是特异的。因此，DNA链的断裂只在G发生。第21页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.2.2化学修饰法测序图解第22页，课件共29页，创作于2023年2月CT+CG+AATTATCAGGATGGCGACTTCGAG+AT+CC试试看你作对了吗？第23页，课件共29页，创作于2023年2月2.5.2.3Maxam－Gilbert化学修饰法优点不需要体外酶催合成反应单双链都可以需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行第24页，课件共29页，创作于2023年