第一单元蛋白质化学

第一单元蛋白质化学第1页，课件共143页，创作于2023年2月1氨基酸:蛋白质的构件分子2氨基酸的分类3氨基酸的酸碱化学4氨基酸的化学反应5氨基酸的光学活性和光谱性质6氨基酸混合物的分析分离第2页，课件共143页，创作于2023年2月1氨基酸:蛋白质的构件分子酸水解：HCL、H2SO4引起消旋，但色氨酸破坏，羟基氨基酸部分水解，酰胺键水解。

碱水解：NaOH水解完全，会引起消旋，但色氨酸不破坏

酶水解：胰蛋白酶、胃蛋白酶水解不完全，不引起消旋，色氨酸不破坏，主要用于蛋白质的部分水解。

1.1蛋白质的水解蛋白质是由氨基酸构成的第3页，课件共143页，创作于2023年2月组成蛋白质的20种氨基酸称为基本氨基酸。它们中除脯氨酸外都是α-氨基酸，即在α-碳原子上有一个氨基。1.2α-氨基酸的一般结构第4页，课件共143页，创作于2023年2月2氨基酸的分类2.1常见的蛋白质氨基酸2.2不常见的蛋白质氨基酸2.3非蛋白质氨基酸第5页，课件共143页，创作于2023年2月2.1常见的蛋白质氨基酸氨基酸有两种分类方法：(1)按侧链R基的结构(2)按侧链R基的极性第6页，课件共143页，创作于2023年2月按侧链R基的结构（1）脂肪簇氨基酸①中性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile②含羟基或硫氨基酸：Ser、Thr、Cys、Met③酸性氨基酸及其酰胺：Asp、Glu、Asn、Gln④碱性氨基酸：Lys、Arg（2）芳香簇氨基酸Phe、Tyr、Trp（3）杂环簇氨基酸His、Pro第7页，课件共143页，创作于2023年2月（1）非极性R基氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp（2）不带电荷的极性R基氨基酸Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln（3）带正电荷的R基氨基酸（4）带负电荷的R基氨基酸Lys、Arg、HisAsp、Glu按侧链R基的极性氨基酸有两种分类方法第8页，课件共143页，创作于2023年2月编码蛋白质氨基酸的结构、代号中性氨基酸第9页，课件共143页，创作于2023年2月第10页，课件共143页，创作于2023年2月第11页，课件共143页，创作于2023年2月第12页，课件共143页，创作于2023年2月第13页，课件共143页，创作于2023年2月第14页，课件共143页，创作于2023年2月第15页，课件共143页，创作于2023年2月

根据生物体的需要，可将氨基酸分为：必需氨基酸半必需氨基酸非必需氨基酸其余氨基酸ArgHisLys、ValIleLeupheMetTrpThr编码蛋白质的氨基酸分类第16页，课件共143页，创作于2023年2月2.2不常见的蛋白质氨基酸有些不常见的氨基酸在某些蛋白质中存在，是由相应的常见氨基酸经修饰而来。在结缔组织的胶原蛋白中有5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸；肌球蛋白含有甲基化的氨基酸（6-N-甲基赖氨酸）；凝血酶原中发现了γ－羧基谷氨酸；细菌紫膜质中存在焦谷氨酸；甲状腺蛋白中Tyr的衍生物：

3.5

-二碘酪氨酸、甲状腺素等。第17页，课件共143页，创作于2023年2月第18页，课件共143页，创作于2023年2月2.3非蛋白质氨基酸除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能。（1）L-型α–氨基酸的衍生物：L-瓜氨酸和L-鸟氨酸（2）D-型氨基酸：D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸：β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。第19页，课件共143页，创作于2023年2月3氨基酸的酸碱化学氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是以兼性离子的形式存在。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。3.1氨基酸的兼性离子形式第20页，课件共143页，创作于2023年2月

氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。Asanacid（protondonor）：Asabase（protonacceptor）：3.2氨基酸的解离第21页，课件共143页，创作于2023年2月3.3氨基酸的等电点H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸H3N—CH—COO-R+在晶体状态或水溶液中的氨基酸H2N—CH—COO-R在碱性溶液中的氨基酸调节氨基酸溶液的pH，可以使氨基酸处于正负电荷相等即净电荷为零得兼性离子状态。此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。（pH=pI）净电荷=0（pH＞pI）净电荷为负（pH＜pI）净电荷为正3.3.1定义第22页，课件共143页，创作于2023年2月氨基酸在等电点状态下，溶解度最小。pH

>

pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。pH

=

pI时，氨基酸净电荷为零。pH

<

pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-NH3+，向负极移动。第23页，课件共143页，创作于2023年2月

实验证明在等电点时，氨基酸主要以兼性离子状态存在，少数解离成数目相等的阳离子和阴离子，以及极少数为中性分子。

第24页，课件共143页，创作于2023年2月3.3.2氨基酸等电点的确定1）酸碱滴定2）根据解离常数pK值计算第25页，课件共143页，创作于2023年2月甘氨酸滴定曲线一氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´1+pK´21）酸碱滴定Titrationofanaminoacid.Shownhereisthetitrationcurveof0.1Mglycineat25C.第26页，课件共143页，创作于2023年2月2）根据pK值中性氨基酸：以Gly为例pIGly=（pK1+pK2）/2=（2.34+9.60）/2=5.97第27页，课件共143页，创作于2023年2月酸性氨基酸，以Asp为例：第28页，课件共143页，创作于2023年2月碱性氨基酸，以Lys为例：第29页，课件共143页，创作于2023年2月氨基酸等电点的计算

氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK′值之和的二分之一。

PI＝（PK左’+PK右’）/2pI=2pK´1+pK´2一氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´2+pK´3二氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´1+pK´2一氨基二羧基AA的等电点计算：第30页，课件共143页，创作于2023年2月氨基酸两性离子的NH3+是弱酸，其pKa为9.7左右，完全离解时溶液的pH约为10±，超出酸碱滴定指示剂的显色范围，不能用一般指示剂，例如酚酞，作酸碱滴定。但当氨基酸的氨基与中性甲醛结合成氨基酸二羟甲基衍生物后，其氨基的碱性即大大减少，反应向右进行，两性离子中NH3+基的酸性解离增加，NH3+的pKa值降低到6.5左右，溶液的pH降至6.7左右，此时NH3+离解释出的H+即可以酚酞作指示剂用标准NaOH溶液加以滴定。每释出的一个H+就相当于一个氨基酸。甲醛滴定可用来测定蛋白质的水解程度。当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pHl2左右移至9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域。这就是甲醛滴定法的基础。3.4氨基酸的甲醛滴定第31页，课件共143页，创作于2023年2月4氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应主要是指它的α-氨基和α-羧基以及侧链上的功能团所参与的反应。4.1α-氨基参加的反应4.2α-羧基参加的反应4.3α-氨基和α-羧基共同参加的反应4.4侧链R基参加的反应。第32页，课件共143页，创作于2023年2月4.1α-氨基参加的反应4.1.1与亚硝酸的反应含游离α-氨基的氨基酸能与亚硝酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被氧化成羟酸。含亚氨酸的脯氨酸则不能与亚硝酸反应。第33页，课件共143页，创作于2023年2月

生成的N2可用气体分析仪器加以测定，

即可算出氨基酸的含量。VanSlyke氨基氮测定法就是根据此反应原理。第34页，课件共143页，创作于2023年2月Cbz-ClCbz-氨基酸4.1.2酰基化反应

氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用，氨基被酰基化。常作为蛋白质合成中氨基的保护试剂。苄氧酰氯（Cbz-Cl）:第35页，课件共143页，创作于2023年2月氨基酸与5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（dansylchloride,DNS）的反应第36页，课件共143页，创作于2023年2月4.1.3烃基化反应DNFB（dinitrofiuorobenzene）二硝基苯氨基酸DNP-Aa(黄色)++HF弱碱中氨基酸α-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸1）氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应第37页，课件共143页，创作于2023年2月H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOHRDNS-氨基酸DNS取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高第38页，课件共143页，创作于2023年2月2）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应苯硫乙内酰脲氨基酸(PTH-AA)苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-AA)少一个氨基酸的多肽1950年能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。设计出“多肽顺序自动分析仪”第39页，课件共143页，创作于2023年2月4.2α-羧基参加的反应1)成酯和成盐反应(碱或醇，羧基被保护)2)酰氯化反应酰化试剂，-COCl，羧基活化3)脱羧反应（胺）4)叠氮反应（叠氮试剂，羧基活化）p138第40页，课件共143页，创作于2023年2月4.3α-氨基和α-羧基共同参加的反应4.3.1与茚三酮的反应（颜色反应）第41页，课件共143页，创作于2023年2月对脯氨酸和羟脯氨酸反应则生成黄色化合物，其结构如下所示：反应生成的化合物的颜色深浅程度以及CO2生成量，均可作为氨基酸定量分析依据。第42页，课件共143页，创作于2023年2月A.该反应由NH2与COOH共同参与B.α-氨基酸反应，生成蓝紫色化合物C.该反应非常灵敏，微克级就可以反应D.可在570nm测定吸光值，测定aa的含量E.可通过二氧化碳测定氨基酸含量。F.脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色化合物。应用：A.氨基酸定量分析（先用层析法分离）B.氨基酸自动分析仪：用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。与茚三酮反应要点第43页，课件共143页，创作于2023年2月4.4侧链R基参加的反应氨基酸的侧链基团R有下列几种：1．苯环(苯丙氨酸及酪氨酸)2．酚基(酪氨酸)3．OH基(丝氨酸、苏氨酸)4．SH基及—S—S—键(半胱氨酸及胱氨酸)5．吲哚基(色氨酸)6．胍基(精氨酸)7．咪唑基(组氨酸)第44页，课件共143页，创作于2023年2月1）-S-S-和-SH的氧化还原反应R-SH：HS-CH2CH2OH巯基乙醇（mercaptoethanol）HS-CH2COOH巯基乙酸（mercaptoaceticacid）HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）还原剂氧化剂第45页，课件共143页，创作于2023年2月

半胱氨酸的-SH很活泼，很容易在空气中重新氧化形成二硫键，一般可用卤代化物对-SH进行保护。第46页，课件共143页，创作于2023年2月（2）苯环的黄色反应phe+少量浓H2SO4+浓HNO3

黄色TyrorTrp+浓HNO3

黄色第47页，课件共143页，创作于2023年2月（3）酚基的Millon反应（米伦氏反应）HgNO3

Tyr+ Hg(NO3)2

红色HNO3

第48页，课件共143页，创作于2023年2月（4）pauly反应His+重氮苯磺酸红色（棕红色）Tyr+重氮苯磺酸橘黄色第49页，课件共143页，创作于2023年2月（5）Folin---酚反应+磷钼酸Tyr磷钨酸orTrp蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）第50页，课件共143页，创作于2023年2月5氨基酸的光学活性和光谱性质5.1一般物理性质无色晶体，熔点极高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差别较大（极性和非极性），能溶于稀酸、稀碱，不溶于有机溶剂。手性碳原子：与α-碳原子相连的四个原子或基团各不相同。5.2旋光性第51页，课件共143页，创作于2023年2月

组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“＋”号表示。第52页，课件共143页，创作于2023年2月比旋光度（单位浓度和单位长度下的旋光度）是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。第53页，课件共143页，创作于2023年2月5.3氨基酸的构型

构型（configuration）

：一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，凡是与L－甘油醛构型相同的，就定义为L－氨基酸，反之为D－氨基酸。第54页，课件共143页，创作于2023年2月5.4氨基酸的光学活性和立体化学Gly一种构型,无旋光性Thr和Ile有四种光学异构体。其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸）。第55页，课件共143页，创作于2023年2月蛋白质的酸或酶促水解得到的氨基酸都是L-型的，而用碱水解得到的都是无旋光性的DL-〔外〕消旋物。胱氨酸可以形成内消旋胱氨酸。外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。内消旋物：分子内消旋胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是消旋物第56页，课件共143页，创作于2023年2月构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。蛋白质最大紫外吸收峰在280nm处。5.5氨基酸的光谱性质第57页，课件共143页，创作于2023年2月6氨基酸混合物的分析分离层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析（HPLC）等。第58页，课件共143页，创作于2023年2月层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。层析系统固定相（静相）流动相（动相）6.1分配层析法的一般原理第59页，课件共143页，创作于2023年2月第60页，课件共143页，创作于2023年2月固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。第61页，课件共143页，创作于2023年2月混合物在层折系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述。Kd=CA/CB利用层析法分离混合物例如氨基酸混合物，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异。一般差异越大，越容易分开。CA：一种物质在A相（流动相）中的浓度CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度第62页，课件共143页，创作于2023年2月按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。第63页，课件共143页，创作于2023年2月6.2分配柱层析层析柱中的填充物或称支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维索、淀粉、硅胶等：支持剂吸附着一层不会流动的结合水，可以看作为固定相，沿固定相流动的与它不互溶的溶剂(如苯酚、正丁醇等)是流动相。第64页，课件共143页，创作于2023年2月6.3（滤）纸层析滤纸层析也是分配层析的一种。滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，混合氦基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。可用于氨基酸的定性和定量测定第65页，课件共143页，创作于2023年2月第66页，课件共143页，创作于2023年2月6.4薄层层析把支持剂涂布在玻璃板上使成一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层，使样品中各个成分分离开来，最后进行鉴定和定量测定。第67页，课件共143页，创作于2023年2月

原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。6.5离子交换层析第68页，课件共143页，创作于2023年2月6.6气相色谱当层折系统的流动相为气体，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时，此层析技术称为气—液色谱(gas-liquidchromatography)或简称为气相色谱。利用气相色谱法进行分离也是基于分配过程，即利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相中的分配系数不同达到分离组分的目的。气相色谱法具有微量快速的优点。它在分析生物成分方面的一个限制是要求样品能气化和热稳定性高。氨基酸由于含有各种极性基团，气化十分困难，必须把它转变成容易挥发的化合物才能进行气相层析。氨基酸与苯异硫氰酸酯反应生成PTH—氨基酸，然后经三甲基硅烷基化，可得能很好气化的氨基酸衍生物。第69页，课件共143页，创作于2023年2月SP-2100

气相色谱仪器以气体为流动相。当某一种被分析的多组份混合样品被注入注样器且瞬间汽化以后，样品由流动相气体载气所携带，经过装有固定相的色谱柱时，分子在两相间反复多次分配，发生很大的分离效果，且由于每种样品组份吸附、脱附的作用力不同，所反应的时间也不同，最终结果使混合样品中的组份得到完全地分离。被分离的组份顺序进入检测器系统，由检测器转换为电信号送至记录仪或积分仪绘出色谱图。第70页，课件共143页，创作于2023年2月高效液相色谱（HighPe-rformanceLiauidChromatography，HPLC）是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。高效液相色谱法是用来分离，分析难挥发和热稳定性差的有机样品的重要手段。由于具有高分辨率、高灵敏度、速度快、和应用范围广的特点,因而已经被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。HPLC作为一种重要的分析方法，目前已成为生物化学家和医学家在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具。6.7高效液相色谱（HPLC）第71页，课件共143页，创作于2023年2月HPLC的特点是：(1)使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大。(2)溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增大，多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析、离子交换层析、吸附层析以及凝胶过滤等。第72页，课件共143页，创作于2023年2月第四章蛋白质的共价结构第73页，课件共143页，创作于2023年2月蛋白质的一级结构1蛋白质通论2肽3蛋白质一级结构的测定4蛋白质的氨基酸序列与生物功能4.5肽与蛋白质的人工合成第74页，课件共143页，创作于2023年2月1蛋白质通论1.1蛋白质的化学组成和分类1.2蛋白质的形状和大小1.3蛋白质功能的多样性第75页，课件共143页，创作于2023年2月各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。由于体内组织的主要含氮物是蛋白质，因此，只要测定生物样品中的氮含量，就可以按下式推算出蛋白质大致含量：蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.25

这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据1.1蛋白质的化学组成和分类单纯蛋白质的元素组成为C50～55%、H6%～7%、O19%～24%、N13%～19%，除此之外还有S0～4%。有的蛋白质含有P、I。少数含Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo等金属元素。第76页，课件共143页，创作于2023年2月

三聚氰胺蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16％左右，而三聚氰胺的含氮量为66％左右。常用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量乘以6.25来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高，从而使劣质食品和饲料在检验机构只做粗蛋白质简易测试时蒙混过关。有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，所以掺杂后不易被发现。

第77页，课件共143页，创作于2023年2月单纯蛋白质（simpleprotein)：仅由氨基酸组成，不含其它化学成分。缀合蛋白质(conjugatedprotein)：除含有氨基酸外的各种化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为辅基(prostheticgroup)或配体(ligand)。第78页，课件共143页，创作于2023年2月单纯蛋白质分类第79页，课件共143页，创作于2023年2月结合蛋白质分类第80页，课件共143页，创作于2023年2月1.2蛋白质的形状和大小形状纤维状球状膜蛋白蛋白质的相对分子量从大约6000～1×106或更大一些一般将分子量小于6000的称为肽蛋白质分子量≌氨基酸数目X110第81页，课件共143页，创作于2023年2月单体蛋白质(monomericprotein)：仅由一条多肽链组成。其相对分子量除以110估计氨基酸残基的数目。寡聚蛋白质(oligomericprotein)：由两条或多条多肽链组成。每条多肽链称为亚基(subunit)。第82页，课件共143页，创作于2023年2月

蛋白质（protein）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者。1.4蛋白质功能的多样性第83页，课件共143页，创作于2023年2月1878年，思格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”催化功能；结构功能；运输功能；储藏功能；运动功能；防御功能；调节功能；感觉功能；遗传调控功能；

蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种特异性的结构基础。第84页，课件共143页，创作于2023年2月催化功能

生物体内的酶大部分是由蛋白质构成的，它们是有机体新陈代谢的催化剂。己糖激酶第85页，课件共143页，创作于2023年2月结构功能蛋白质可以作为生物体的结构成分。在高等动物里，胶原是主要的细胞外结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架，占蛋白总量的1/4。细胞里的片层结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。第86页，课件共143页，创作于2023年2月运输功能脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过程中起着运输氧气的作用。血液中的β1-脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁。一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。第87页，课件共143页，创作于2023年2月贮存功能某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。第88页，课件共143页，创作于2023年2月运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。第89页，课件共143页，创作于2023年2月防御功能高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。第90页，课件共143页，创作于2023年2月调节功能

某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。第91页，课件共143页，创作于2023年2月感觉功能感受味道需要味觉蛋白视觉信息的传递要有视紫红质参与。视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。第92页，课件共143页，创作于2023年2月遗传调控功能遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNA在储存时是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。β－半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成β－半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。第93页，课件共143页，创作于2023年2月近年来的研究还指出记忆、痛苦、感情靠的是蛋白质的构象变化几年前，在欧洲乃至全世界引起恐慌的疯牛病，其致病元凶就是蛋白粒子（prion），这种只有蛋白质而没有核酸的病原体，可引起人或动物的疯牛病，这一发现又一次说明了蛋白质是生命的物质基础。

总而言之，一切重要的生理活动都离不开蛋白质，蛋白质是生命现象的最基本的物质基础。第94页，课件共143页，创作于2023年2月2肽2.1肽和肽键的结构2.2肽的物理和化学性质2.3天然存在的活性肽第95页，课件共143页，创作于2023年2月肽：一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基在适当的条件下脱水缩合而成化合物。肽键：氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）肽是氨基酸的线性聚合物，常称多肽链（peptidechain）2.1肽和肽键的结构第96页，课件共143页，创作于2023年2月肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。N=C0.127nm键长=0.132nmN-C0.148nm肽键第97页，课件共143页，创作于2023年2月第98页，课件共143页，创作于2023年2月

1.

由于C=O双键中的π电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。

2.与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构，称为肽单元或肽键平面。由于α-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转。肽平面或酰胺平面：第99页，课件共143页，创作于2023年2月氨基酸残基：组成多肽的氨基酸单元氨基端或N-端：通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基羧基端或C-端：在另一端含有一个游离的-羧基，N端氨基酸残基氨基酸残基C端多肽链片断结构通式第100页，课件共143页，创作于2023年2月二肽：由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。氨基酸BH2NCHCR1OHNCHCR2OOH氨基酸AHHNCHCR1O氨基酸COH氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基第101页，课件共143页，创作于2023年2月★多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个酰胺平面组成第102页，课件共143页，创作于2023年2月肽链中包含的共价键（covalentbonds）主要指肽键（peptidebond）和二硫键（disulfidebond）二硫键：是由肽链中相应部位上两个半胱氨酸残基脱氢连接而成，是连接肽链内或肽链间的主要桥键。第103页，课件共143页，创作于2023年2月N末端C末端牛核糖核酸酶第104页，课件共143页，创作于2023年2月丙氨酰甘氨酰亮氨酸

Ala－Gly－Leu(orAla•Gly•Leu)根据氨基酸组成，由N端→C端命名,称为某氨基酰某氨基酰…某氨基酸。第105页，课件共143页，创作于2023年2月肽链写法：游离α-氨基在左，游离α-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。H2N-丝氨酸-缬氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-谷氨酰氨-COOHSer-Val-Tyr-Asp-Gln（S-V-Y-D-Q）第106页，课件共143页，创作于2023年2月肽的化学反应也和氨基酸一样，游离的α－氨基、α－羧基和R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反反应。双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。2.2肽的物理和化学性质第107页，课件共143页，创作于2023年2月在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg/mL。双缩脲法可用于肽、蛋白质的定性、定量分析。具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。第108页，课件共143页，创作于2023年2月2.3天然存在的活性肽许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。具有一定生物学活性的肽类物质称生物活性肽。生物活性肽是传递细胞之间信息的重要信息分子在调节代谢、生长、发育、繁殖等生命活动中起着重要作用生理活性肽的功能类别：激素、促激素、神经调质以及许多器官合成、释放的功能调节因子第109页，课件共143页，创作于2023年2月这类物质大都是一些寡肽（几个氨基酸构成）或低肽（十几个氨基酸构成），氨基酸数目比较少，不同的排列、组合就可产生各种不同生物功能。由于生物活性肽对机体的重要作用，使它具备了巨大的开发价值。肽类物质除营养等作用外，在生物制药、功能食品、美容、科研及诊断试剂方面存在着广泛的应用前景。第110页，课件共143页，创作于2023年2月

谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。谷胱甘肽（GSH）三肽第111页，课件共143页，创作于2023年2月均为9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。催产素和升压素第112页，课件共143页，创作于2023年2月促肾上腺皮质激素（ACTH）39肽，活性部位为第4～10位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。脑肽脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。Met-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。第113页，课件共143页，创作于2023年2月3蛋白质一级结构的测定3.1蛋白质测序的策略3.2N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定3.3二硫桥的断裂3.4氨基酸组成的分析3.5多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化3.6肽段氨基酸序列的测定3.7肽段在多肽链中次序的决定3.8二硫桥位置的确定3.9蛋白质测序举例3.10蛋白质序列数据库第114页，课件共143页，创作于2023年2月1测定蛋白质分子量及肽链数目a、样品必须是均一的，纯度应在97%以上；b、测定蛋白质的分子质量（电泳、层析、离心等），其误差允许在10%左右。c、通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质相对分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。第115页，课件共143页，创作于2023年2月3.1蛋白质测序的策略(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。

(2)拆分蛋白质分子的多肽链。

(3)测定多肽链的氨基酸组成。

(4)分析多肽链的N末端和C末端残基。

(5)断裂多肽链内的二硫键。

(6)多肽链断裂成肽段。

(7)测定各个肽段的氨基酸顺序。

(8)确定肽段在多肽链中的次序。

(9)确定原多肽链中二硫键的位置。第116页，课件共143页，创作于2023年2月FrederickSanger

多肽链的氨基酸测序的方法由英国科学家FrederickSanger发明。这个方法首先应用于牛胰岛素的序列测定，并于1954年取得成功，FrederickSanger也因此获得1958年的Nobel奖。这项工作在结构生物学上具有里程碑式的意义。现在的蛋白质自动测序仪也是以Sanger的方法为基础发展起来的。第117页，课件共143页，创作于2023年2月将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序

将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质蛋白质顺序测定基本方法路线第118页，课件共143页，创作于2023年2月3.2N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定1)N-末端分析（1）DNFB法；（2）DNS法（3）PITC法（4）氨肽酶法2)C-末端分析（1）肼解法；（2）还原法（3）羧肽酶法第119页，课件共143页，创作于2023年2月Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。末端基氨基酸测定二硝基氟苯（DNFB）法第120页，课件共143页，创作于2023年2月在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。末端基氨基酸测定丹磺酰氯法(DNS)第121页，课件共143页，创作于2023年2月氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端基氨基酸测定氨肽酶(aminopeptidases)法第122页，课件共143页，创作于2023年2月此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。末端基氨基酸测定肼解法第123页，课件共143页，创作于2023年2月羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。末端基氨基酸测定羧肽酶(carboxypeptidase)法第124页，课件共143页，创作于2023年2月3.3二硫桥的断裂断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。ssHCOOOHSO3HSO3H第125页，课件共143页，创作于2023年2月3.4氨基酸组成的分析用于蛋白的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪图谱第126页，课件共143页，创作于2023年2月方法：6MHcl优点：不引起消旋，能得到L-氨基酸（17种）缺点：Trp侧链的吲哚基团被破坏；Asn，Gln的酰胺基团被水解，变成Asp，Glu酸水解：方法：5MNaOH优点：Trp缺点：多数氨基酸会不同程度的破坏，产生消旋。碱水解：第127页，课件共143页，创作于2023年2月3.5多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化1)酶裂解法胰蛋白酶(trypsin)这是最常用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。得到的是以Arg或Lys为C-末端残基的肽段，肽段数目等于多肽链中Arg和Lys总数加1。第128页，课件共143页，创作于2023年2月为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以通过化学修饰将其侧链基因保护起来。用马来酸酐可以保护Lys残基侧链上的ε－NH2，胰蛋白酶就不会水解Lys竣基参与形成的肽键，只能断裂Arg羧基所形成的肽键；反之，如果用1，2－环己二酮修饰Arg的胍基，则胰蛋白面只能裂解Lys羧基所形成的肽键。如果想增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点，可以用丫丙啶处理多肽链样品，这时Cys残基侧链被修饰成类似Lys的侧链，也具有ε－NH2。这样胰蛋白酶便能断裂Cys羧基端的肽键。R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。第129页，课件共143页，创作于2023年2月糜蛋白酶(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)：它断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。断裂键邻近的基团是碱性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力将减弱。肽链水解位点R1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。第130页，课件共143页，创作于2023年2月肽链水解位点胃蛋白酶(pepsin)它要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的最适pH，前者是pH2，后者是pH8-9，由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。第131页，课件共143页，创作于2023年2月消化道内几种蛋白酶的专一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）第132页，课件共143页，创作于2023年2月2)