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测序常见问题及其分析1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2■ CG1:G TTCGGIGGT6TT NT-'■C 7GG&C.SICIGCCCTffCLCTC解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE，纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。3、样品有杂合/突变位点GCa.TG.TCCCT TCNGTGTGTG ACvMW-bbig.iQEvMW-bbig.iQE模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位黑占一般都罩一的峰形，然后突然在某一彳固位黑占出现重叠峰（如图中箭^所示）。

解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。4、polyA/T和C/Gcluster导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4图4-4TCT□TTTTTTTT<3TTGT<SGTTT'TTTTTTTTTTTTTTTTTJiCCCHKUCCT?'HNTTN.MTTTRACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。C/Gcluster在PrV基因组测序时遇到过，后来还是让TaKaRa公司给解决了。5、基因中含有重复序列可能的原因：样品中含有重彳复序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致Frame滑动，较短的重彳复序列会导致测序结果出现移码；而较长的重彳复序列会使定序信号衰减。

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