工业微生物的菌种选育与保藏

工业微生物的菌种选育与保藏第1页，课件共113页，创作于2023年2月第一节菌种的分离简介

一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。第2页，课件共113页，创作于2023年2月二、分离思路

新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。第3页，课件共113页，创作于2023年2月定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤第4页，课件共113页，创作于2023年2月

（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主。富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。第5页，课件共113页，创作于2023年2月从自然界筛选第6页，课件共113页，创作于2023年2月2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。第7页，课件共113页，创作于2023年2月（二）增殖培养

为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。第8页，课件共113页，创作于2023年2月（三）培养分离

尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。划线分离法稀释分离法第9页，课件共113页，创作于2023年2月（四）筛选

这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。第10页，课件共113页，创作于2023年2月（五）毒性试验

自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第11页，课件共113页，创作于2023年2月第二节培养分离

从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。第12页，课件共113页，创作于2023年2月一、成功的分离培养方法(1)认真考它所需产品的特征和生产过程；(2)制订初步的筛选标准；(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。第13页，课件共113页，创作于2023年2月二、培养分离中要解决的问题1、“分离什么和从哪里分离出?”

2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。第14页，课件共113页，创作于2023年2月三、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点1．罗列出所要分离的微生物类群；2．根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地：3．将若干样本分成若干类型，如植物和植物各部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；4．罗列出所要考察和测量的环境参数，如pH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等；第15页，课件共113页，创作于2023年2月

5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；

6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；

7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法；

8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；

9．运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。第16页，课件共113页，创作于2023年2月四、自然界中细菌的分离第17页，课件共113页，创作于2023年2月

(一)采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。第18页，课件共113页，创作于2023年2月采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；第19页，课件共113页，创作于2023年2月5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长第20页，课件共113页，创作于2023年2月1．土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。第21页，课件共113页，创作于2023年2月2．植物体采集方法

在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。第22页，课件共113页，创作于2023年2月

3．水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。第23页，课件共113页，创作于2023年2月(二)生态学参数及培养基

的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。第24页，课件共113页，创作于2023年2月3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50μg／m1，以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l－2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。第25页，课件共113页，创作于2023年2月土中细菌的富集培养与分离

分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。第26页，课件共113页，创作于2023年2月富集方法运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。富集可以促进抗性的产生并维持下来。第27页，课件共113页，创作于2023年2月土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。第28页，课件共113页，创作于2023年2月水中细菌分离的简易富集技术

在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。第29页，课件共113页，创作于2023年2月次代培养及纯化步骤1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。第30页，课件共113页，创作于2023年2月五、放线菌的分离(一)采样及采集方法应尽可能实行无菌操作。所采集的样本应具有一定的代表性。样本采集完后，应及时处理或在4℃下贮存，贮存试样处应与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。第31页，课件共113页，创作于2023年2月

(二)生态学参数

放线菌分离培养过程中所需考虑的生态参数有温度、pH、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。第32页，课件共113页，创作于2023年2月（三）培养基的组成原则大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养箱中存放3天。第33页，课件共113页，创作于2023年2月放线菌的分离土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。第34页，课件共113页，创作于2023年2月次代培养及纯化菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。第35页，课件共113页，创作于2023年2月六、真菌分离1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。第36页，课件共113页，创作于2023年2月4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。第37页，课件共113页，创作于2023年2月真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。第38页，课件共113页，创作于2023年2月七、生产选种

是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。第39页，课件共113页，创作于2023年2月第三节工业菌种的育种方针工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。第40页，课件共113页，创作于2023年2月工业菌种育种的方法诱变基因转移基因重组第41页，课件共113页，创作于2023年2月育种过程包括下列3个步骤：

(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。第42页，课件共113页，创作于2023年2月选择育种方法时综合考虑的因素

(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)；

(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度；

(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。第43页，课件共113页，创作于2023年2月工业菌种改良方法(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。

(2)增加前体物的浓度。

(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。第44页，课件共113页，创作于2023年2月(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。第45页，课件共113页，创作于2023年2月

提高特定基因的表达水平(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。(2)诱导解除基因表达抑制的突变。第46页，课件共113页，创作于2023年2月

改进菌种的生长效率提高菌株对底物的利用率方法：

a.通过确定并改变代谢中的耗能部分;b.由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。

c.赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用。第47页，课件共113页，创作于2023年2月第四节诱变育种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。第48页，课件共113页，创作于2023年2月诱变物理、化学或生物诱变方法第49页，课件共113页，创作于2023年2月

一、诱变剂和诱变处理

物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。第50页，课件共113页，创作于2023年2月化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。

第51页，课件共113页，创作于2023年2月2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射±行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。第52页，课件共113页，创作于2023年2月诱变剂的选择1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。第53页，课件共113页，创作于2023年2月3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。第54页，课件共113页，创作于2023年2月二、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选第55页，课件共113页，创作于2023年2月(一)出发菌株的选择1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。第56页，课件共113页，创作于2023年2月5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。

6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。第57页，课件共113页，创作于2023年2月

(二)处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。第58页，课件共113页，创作于2023年2月(三)诱变处理

根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。第59页，课件共113页，创作于2023年2月

(四)中间培养

由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。第60页，课件共113页，创作于2023年2月

方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。第61页，课件共113页，创作于2023年2月(五)分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.

例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。第62页，课件共113页，创作于2023年2月紫外线的诱变育种

紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。第63页，课件共113页，创作于2023年2月亚硝基胍诱变曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。第64页，课件共113页，创作于2023年2月第五节营养缺陷型的选育营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。与营养缺陷型对应的是野生型。第65页，课件共113页，创作于2023年2月能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。第66页，课件共113页，创作于2023年2月营养缺陷型的用途

营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。第67页，课件共113页，创作于2023年2月筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱第68页，课件共113页，创作于2023年2月一、诱变方法物理诱变化学诱变第69页，课件共113页，创作于2023年2月二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。第70页，课件共113页，创作于2023年2月

三、检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法第71页，课件共113页，创作于2023年2月1．将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2．将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。3．将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。

(一)影印法第72页，课件共113页，创作于2023年2月4．将CM和MM在恒温箱中培养。5．二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于GM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。第73页，课件共113页，创作于2023年2月

(二)点种法也就是任意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。第74页，课件共113页，创作于2023年2月

(三)夹层法先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。第75页，课件共113页，创作于2023年2月四、营养缺陷型生长谱的确定

验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。第76页，课件共113页，创作于2023年2月生长谱测定的方法将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5～6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。—个平皿测一个菌。第77页，课件共113页，创作于2023年2月以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在5～6个平皿上可测20株菌以上。第78页，课件共113页，创作于2023年2月第六节基因育种基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。第79页，课件共113页，创作于2023年2月第七节原生质体育种

原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。第80页，课件共113页，创作于2023年2月一、开发新的代谢产物的途径

(1)从自然界分离新的微生物菌株，或采用新的检阅方法筛选新的代谢产物。(2)对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。(3)利用微生物转化改造代谢产物的结构。

(4)通过原生质体融合获得新的代谢产物。(5)DNA重组技术。第八节筛选新的代谢产物

第81页，课件共113页，创作于2023年2月二、筛选微生物新的代谢产物的程序

第82页，课件共113页，创作于2023年2月突变型菌株的筛选

一、产量性状突变株的筛选第83页，课件共113页，创作于2023年2月

三、筛选微生物代谢产物的目标

筛选克服抗生素抗性菌株的活性物质；筛选抗肿瘤、抗病毒的活性物质；研究有药理活性的酶抑制剂及免疫调节剂；寻找食品工业最好的酵母培养物；筛选降解有害物质的微生物以及治疗上具有低毒、长效的化学药物等。

第84页，课件共113页，创作于2023年2月四、筛选微生物代谢产物的方法

(一)直接方法为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途，在体外试验测得活性后，可以将培养液的有效成分直接作用于机体，观察被测样品的疗效。这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体内治疗试验。第85页，课件共113页，创作于2023年2月第86页，课件共113页，创作于2023年2月(二)间接方法筛选医用抗生素，可用细茵、真菌、病毒或肿瘤模型，寻找抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤抗生素、酶抑制剂、免疫制剂等有效物质。在预筛选时，多用琼脂平扳扩散抑菌法。通过预筛选，直接测定最初分离物的生物活性，能加速筛选过程。

第87页，课件共113页，创作于2023年2月

五、检测系统

筛选过程的成功依赖于排除那些已知的或并非需要的代谢产物的检验方法，这样才能识别出人们需要的化合物。第88页，课件共113页，创作于2023年2月性能签别

性能鉴别是分离和筛选微生物代谢产物中最基础的工作。鉴别可分为两方面：

①对微生物方面进行形态、培养、生化功能答试验观察，并确定微生物产生菌的类群；②从化学的早期鉴别来鉴别微生物的代谢产物。化学的早期鉴别一般对产生菌所产生的代谢产物进行纸上层析、薄板层析、纸上电泳、抗茵谱、高压电泳、紫外分光光度法、液相和气相色谱等试验，井获得各种图谱，与已知图谱进行比较鉴别。

第89页，课件共113页，创作于2023年2月如果认为是有实用前途的代谢产物，则要进一步大量培养，并进行动物试验、毒性考查、药物代谢等实验，并进行提高发酵水平和改善提取工艺的工作，以备投入生产。如果是新的代谢产物．一般要进一步确定其化学结构，井在此基础上进行合成法的研究或进行化学改造，研究结构与生物活性的相互关系，并对作用机制、生物合成过程作进一步的研究。第90页，课件共113页，创作于2023年2月第十节工业微生物菌种保藏技术

在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。第91页，课件共113页，创作于2023年2月一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)

经长期保藏后菌种存活健在；(2)

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。第92页，课件共113页，创作于2023年2月二、工业微生物菌种保藏技术

(1)冷冻干燥或真空干燥保藏；

(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；

(3)

转接培养或斜面传代保藏；

(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。第93页，课件共113页，创作于2023年2月2.1

冷冻保藏

冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。第94页，课件共113页，创作于2023年2月冷冻保藏种类

一、普通冷冻保藏技术(-20℃)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)三、液氮冷冻保藏技术

第95页，课件共113页，创作于2023年2月普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。第96页，课件共113页，创作于2023年2月应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。第97页，课件共113页，创作于2023年2月二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。一般方法：1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。第98页，课件共113页，创作于2023年2月三、液氮冷冻保藏技术

(一)冷冻保护剂

在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。

第99页，课件共113页，创作于2023年2月(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤

1．待冷冻保藏菌种悬液的制备

(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，

第100页，课件共113页，创作于2023年2月(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。第101页，课件共113页，创作于2023年2月2．控速冷冻．(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；第102页，课件共113页，创作于2023年2月(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。第103页，课件共113页，创作于202