质粒DNA的提取实验

实验六 质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒二、实验原理质粒(Plasmid)是独立于染色体外的， 能自主复制且稳定遗传的遗传因子。 它是一种环状的双链 DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。本实验利用 SDS碱裂解法提取质粒 DNA。将细菌悬浮液暴露于高 pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体 DNA和蛋白质变性，将质粒 DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体 DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被 SDS（十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒 DNA。三、实验材料与试剂1、实验材料 大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒 PMD-18T）2、实验试剂(1)溶液Ⅰ：TrisHCl25mmol/L,EDTA10mmol/L,· 葡萄糖50mmol/L；溶液Ⅱ(新鲜配制)：NaOHL,SDS1%(W/V)；溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸,水；氯仿－异戊醇（24：1）；异丙醇、70%乙醇；四、实验步骤（一）提取质粒1.挑转化后的单菌落 (含PMD-18T 质粒)，接种到 20ml含有适当抗生素 (Amp)的丰富培养基中 (LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成）将的培养物倒入的EP管中，于4℃以12000rpm离心1min。3.离心结束,弃去上层培养液，再向离心管中加入的培养物，于 4℃以12000rpm离心1min。弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。5.将细菌沉淀重悬于 100μl冰预冷的溶液Ⅰ中 ,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀 (无块状悬浮)。6.加200μl新配制的溶液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。7.加150μl用冰预冷的溶液III,盖紧管口,反复颠倒数次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3～5min。8.4℃以12000rpm离心5min,将上清液（400μl）转移到另一离心管中。9.加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）振荡混匀。4℃以12000rpm离心5min，将上清液（300μl）转移到另一离心管中。10.加2/3体积的异丙醇沉淀质粒DNA,振荡混匀,于冰上放置15min。11.4℃以12000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。12.加1ml70％乙醇溶液洗涤沉淀，振荡混匀,4℃12000rpm离心5min。弃去上清液，在空气中使DNA沉淀干燥（约5-10分钟）。用20μl灭菌的蒸馏水溶解DNA,加1μl胰RNA酶37℃消化RNA30min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒的提取状况。五、实验结果我组为第 7组，由电泳图谱可以看出，电泳得到 3个条带，条带较为清晰。最前面的一条带为超螺旋的质粒 DNA（分子量 2000bp），中间的条带为两条链均发生断裂而形成的线形 DNA；最慢的条带为一条链发生断裂的开环质粒 DNA。六、思考题1.试述在提取质粒过程中溶液 I、II、III的作用是什么 ?（1）溶液Ⅰ：Tris·HCl25mmol/L,EDTA10mmol/L, 葡萄糖 50mmol/L；主要作用是使细菌悬浮，此外 EDTA 可抑制 DNase的活性。(2)溶液Ⅱ(新鲜配制)：NaOHL,SDS1%(W/V) ；碱会使细胞壁破裂，染色体 DNA和蛋白质变性，将质粒 DNA排放到上清中；在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体 DNA会相互缠绕成大型复合物，可被 SDS包盖。(3)溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸,水；K+置换了 SDS中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾），这些复合物可以从溶液中有效地沉淀下来，经离心除去。描述质粒DNA的电泳图谱，并解释产生的现象及可能的原因？实验中得到的质粒 DNA电泳图谱显示共有三条带，其中：最快的一条带是超螺旋的质粒 DNA；