基因芯片技术基因芯片检测技术

基因芯片技术基因芯片检测技术第1页，课件共77页，创作于2023年2月第3章基因芯片检测技术内容提要：第一节基因芯片检测仪一、基本原理及主要组成部分二、有关检测系统的重要参数及扫描过程

第二节基因芯片扫描仪简介一、激光共聚焦扫描仪二、激光非共聚焦扫描仪三、CCD基因芯片检测仪第三节芯片图像处理一、芯片图像的性质二、芯片图像的处理三、常用的芯片图像处理软件第2页，课件共77页，创作于2023年2月简介：荧光染料发光原理：激发光激发荧光染料，荧光染料产生荧光光子，荧光的强弱可以代表荧光化合物的含量，用光探测器检测并确定荧光化合物的含量，从而计算出DNA或RNA的含量。生物芯片的扫描：目标DNA（或RNA、抗原、抗体、其他受体等）与芯片上的探针反应后，通过仪器将生物芯片上成千上万个点阵的反应结果阅读出来，转变成计算机可以处理的数据的过程。第3页，课件共77页，创作于2023年2月简介：根据生物芯片所使用的标记物不同，相应的信号检测方法有：放射性同位素法、生物素标记法、荧光染料标记法等。目前基因芯片最普遍采用的标记和检测法是荧光法，相应的检测装置主要有：激光共聚焦显微镜、CCD相机、激光扫描荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等。基因芯片检测系统可以分为硬件系统和软件系统两个部分，由于常用的基因芯片检测系统采用扫描的方式得到图像，因此又称为基因芯片扫描仪。第4页，课件共77页，创作于2023年2月扫描仪第5页，课件共77页，创作于2023年2月第一节基因芯片检测仪芯片检测体系的硬件部分主要包括：照明光源光路系统光探测器机械部分A/D转换器第6页，课件共77页，创作于2023年2月一、基本原理及主要组成部分

1.荧光染料与荧光光谱当荧光化合物或者染料受到特定波长的激发光激发后，会吸收激发光子，然后发射荧光光子。各种荧光化合物有各自特定的最大激发光吸收波长和最大发射波长。两峰值波长差值称为斯托克斯位移(Stokesshift)。斯托克斯位移太小，激发光和发射荧光的光谱有较大部分重叠，影响对荧光强度的测量精度。实际中，选取斯托克斯位移较大的荧光材料。荧光强度在一定范围内与激发光的强度成正比。荧光分子受到激发后，以球状方式发射荧光光子Cy3550-570nm20nmCy5649-670nm21nm第7页，课件共77页，创作于2023年2月2.照明光源荧光染料激发光的光源主要包括：激光光源和非激光光源。选择光源遵循两个原则：一是为了提高检测的灵敏度，需要选择高强度的激发光源，以激发较多的荧光光子，二是激发光的波长范围要避免将其所激发的荧光波长覆盖。第8页，课件共77页，创作于2023年2月激光光源单色性好、方向性好、能量集中、亮度高、相干性好、能产生强度较高的发射荧光，可以大大地提高检测灵敏度。为了同时检测多种荧光，在具体实现过程中，光源系统都设计成多波长结构，通常采用多个激光器。气体激光器，比如氦氖激光器，输出连续光，输出光束质量很好，单色性好，稳定性高，输出光为可见光。半导体激光器，波长范围广。体积小，质量轻，价格便宜。第9页，课件共77页，创作于2023年2月非激光光源非激光光源，波长范围比较宽。为了避免激发光对荧光的干扰，通常需要加装滤光片来选择与荧光最大激发波长相吻合的光。要检测多种荧光，采用多个滤光片来选择多种特定的波长。低氩汞灯和短弧氙灯。第10页，课件共77页，创作于2023年2月照明方式照明区域是线和面，可以同时激发大面积的荧光，实现光强的均匀性，主要是非激光光源。激光高相干性，在较大面积上光强很难一致。一般激光光源为点照明方式，为了实现大面积成像，必须通过扫描来实现。第11页，课件共77页，创作于2023年2月3光探测器光探测器是基因芯片扫描仪检测系统的核心器件，其主要用途是探测荧光光子，并把荧光光子的光信号转变成模拟的电信号。目前基因芯片扫描仪所选用的光探测器件各不相同，主要有基于用PMT（photomultipliertube，光电倍增管）和CCD（charge-coupleddevices，电荷偶合器件）作为感光器件的两种。第12页，课件共77页，创作于2023年2月光电倍增管（PMT）将光辐射变成电子流光阴极：执行光电变换倍增级：执行电子的倍增放大阳极：收集电子流第13页，课件共77页，创作于2023年2月光电倍增管（PMT）增益依赖于光电倍增管内部光阴极的数量和加在光电倍增管上的电压，光阴极的数量多、电压高则增益大。电子数目可增加到108芯片扫描仪用光电倍增管的选择应考虑下列两个因素。一是由于不同的光阴极模式对不同的波长的光的灵敏度不一样，因此应选择对被测荧光波长灵敏度高的光电倍增管；而是应选择耐用的高信噪比的光电倍增管。第14页，课件共77页，创作于2023年2月PMT的优点和缺点PMT的优点：光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器，通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度；一般用激光作为激发光源，能激发出较强的荧光，增加灵敏度；通过点成像探测并结合高速XY轴扫描而实现对生物芯片进行扫读，均一性好；可以与共聚焦系统相兼容以降低背景噪声。

PMT的缺点：由于采用点成像探测及XY轴扫描，成像速度较慢，一般需要10分钟以上；虽然激光光源使用寿命可以达到几千小时以上，但光源随着使用时间的延长而老化，其强度逐渐减弱，导致灵敏度随着使用时间的延长而降低。

第15页，课件共77页，创作于2023年2月CCD的优点和缺点CCD的优点：CCD一次可成像很大面积的区域，激发光源多采用氙灯或高压汞灯等高亮度光源，在单一光源下可通过更换滤光片的方式来满足激发不同荧光的需要；由于CCD芯片扫描仪时能同时对整张芯片表面信号进行读取，不需要X-Y二维移动平台，大大提高了获取荧光图像的速度，使得这种扫描速度相对比PMT激光扫描仪要快，一般仅需要0.5-2分钟。缺点：样品点受到的激发光可能不够均匀一致，从而引入测量误差；CCD对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，因而需要额外的放大系统来将信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限。第16页，课件共77页，创作于2023年2月4.光路系统光收集：荧光收集多采用光学透镜系统，透镜收集光的立体角的大小直接影响系统的效率。透镜收集光的效率以数码孔径（NA）表示。NA为1.0，表明透镜收集了整个半球面的光，相对应的光收集效率为50％。多数共聚焦激光微阵列扫描仪物镜的NA为0.5～0.9，而绝大多数CCD阵列扫描仪的NA为0.2～0.5。激发/发射光的识别和分离：由于荧光发射强度要远远小于激发光强度，因此要从激发光中检测出微弱的荧光信号，就需要对这两种类型的光进行分离。

第17页，课件共77页，创作于2023年2月激发/发射光的识别和分离

几何分离：根据激发光和荧光光路的几何关系进行分离。一种方式用一个很小的反光镜将激发光束反射，而让环形部分的荧光光束通过；另一种方式是激发光束和系统光路不同轴，在成像过程中，激发光束所成的像和荧光光束所成的像会发生分离，从而过滤掉激发光束。

波长分离：根据激发光和荧光的波长差异进行分离。根据激发光波长和荧光波长不完全重合的事实，用滤光片将其分离。

第18页，课件共77页，创作于2023年2月激发光的入射角度芯片不平整，芯片表面的灰尘，片基不均匀，环境中的尘粒都会引起光的强烈散射，产生散射光，另外入射光照在芯片上也产生反射光。但干涉滤光片不能完全滤除散射光与反射光。检测角度确定时，杂质微粒引起的散射光的强度与入射光角度有关。入射光与检测角成0度时最强，90度时最弱。但生物芯片扫描仪难以实现与入射光成90度的检测，因为荧光检测必须在芯片的正上方，与芯片垂直，以保证最大的采光量并避免芯片荧光图像的失真。入射光与检测成0度是激光系统芯片扫描仪常采用的方式。CCD系统芯片扫描仪及部分激光系统扫描仪多采用入射光与检测成45度或135度的方式。第19页，课件共77页，创作于2023年2月第20页，课件共77页，创作于2023年2月第21页，课件共77页，创作于2023年2月第22页，课件共77页，创作于2023年2月5.其他器件A／D转换器：将PMT或CCD收集的模拟的电信号转化为数字图像信号。载片台：固定和放置微阵列固相基质的装置，多芯片数扫描仪载片台的大小只能适合标准显微载玻片。机械传动装置：生物芯片检测仪根据相对激光器及探测器是否移动分为扫描检测和固定检测。CCD检测仪大多采用固定检测，PMT扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描，因此需要激光头或载片台的机械运动来使激光扫到整个面积。绝大部分激光共聚焦生物芯片扫描仪采用了载片台移动的检测方法，即将激光器及光探测器固定，生物芯片置于载片台并随着载片台在X方向正反线扫描和Y方向步进向前运动。第23页，课件共77页，创作于2023年2月二、有关检测系统的重要参数

1.信噪比：荧光信号的峰值除以信号的变异。信噪比太低，则表示信号有较大的变异，所得到的结果就不能反映实际的信号值。暗电流噪声：没有光输入时的噪声。暗电流主要是由器件的缺陷和热力学导致的量子涨落引起，因此降低系统温度，可有效地降低暗电流的量值。发射噪声：光输入过程中产生的噪声。越多的光子导致越多的光子数量的变异，因此，发射噪声的绝对数量随着信号的增加而增加。直接来自于器件的物理性质，因此很难避免。此外，基因芯片也会引入噪声，如基因芯片基片玻璃质地或空气中灰尘的荧光本底干扰，基因芯片基片与标记样本之间的非特异杂交等，都会引入一定的荧光噪声。

第24页，课件共77页，创作于2023年2月2.光漂白现象

光漂白是指荧光染料分子在激发光的照射下，其产生荧光的强度随着时间的延长逐渐变弱消失的过程。几乎所有的荧光染料都存在这种光漂白现象,光漂白的程度随光照强度的增加和照射时间的延长而增强。激光系统扫描仪中，聚焦后的激光束直径较小，一般在5～10μm，光强较大，因此光漂白的作用较强。CCD系统虽然激发光较弱，但CCD扫描时通常采用长时间曝光方式，因此也同样存在光漂白现象。第25页，课件共77页，创作于2023年2月在生物芯片扫描中，通常一次扫描产生的光漂白并不显著，可以忽略，但是多次重复扫描产生的光漂白必须考虑。Cy3多次扫描测定，平均每扫描一次，荧光强度下降0.7%。可见光漂的作用还是比较强的。第26页，课件共77页，创作于2023年2月3.灵敏度与动态检测范围

灵敏度是指扫描仪测定最微弱荧光的能力。通常用每平方微米能测定的荧光分子数来表示灵敏度。目前商业生物芯片扫描仪的灵敏度可达0.1～1荧光分子/μm2。动态范围是指仪器能够响应超过噪音水平的信号强度的范围。第27页，课件共77页，创作于2023年2月3.灵敏度与动态检测范围

仪器的动态范围是仪器所有组件共同作用的结果，影响信号的动态范围的因素很多，主要由荧光的物理特性、CCD的动态工作范围和A／D转换器的动态范围等因素决定。对于激光系统，其动态范围可达16位（bit），即216(即65536)灰度值（96分贝）。对于CCD系统，由于不同器件的噪声强度差别很大，一般动态范围为12～16位，即212~16（4096-65536）灰度值（72分贝-96分贝）。第28页，课件共77页，创作于2023年2月灵敏度范围很重要

虽然通常扫描仪的灰度值在0-65535之间，有很大的动态范围，但调节仪器的灵敏度范围对于基因芯片来讲仍是很重要的。第一，在不同的样本之间，由于样本RNA的质量、标记效率和杂交效率等原因，使不同样本之间的荧光强度变化很大；第二，在同一样本内部，不同的基因表达丰度相差极大，高丰度的mRNA可以占mRNA中1％的丰度，而一些微量表达的基因只占mRNA中百万分之一以下的丰度。第29页，课件共77页，创作于2023年2月灵敏度范围很重要

如果扫描仪的灵敏度范围设置不当，会出现两种情况：第一，扫描强度太弱，总体信号太弱，弱信号点（无效点）比例太高，对于大量的低丰度表达基因无法测出；第二，扫描强度太大，总体信号太强，导致大量的点信号达到饱和，饱和点的信号会导致两种荧光信号比值压缩，无法分析差异表达基因，另外，大强度扫描还会导致高背景及激光管迅速老化。第30页，课件共77页，创作于2023年2月调整仪器灵敏度范围的方法

其一是改变激发光的强度，如用激光衰减器可调整改变激发光的强度其可调范围至少为100：1其二是改变光探测器的灵敏度，如果PMT扫描仪，则改变光电倍增管的灵敏度，通过变化输入电压的大小，光电倍增管的灵敏度改变范围至少为100：1对于CCD检测系统，改变镜头的数字光圈可以提高采光效率，从而改变检测灵敏度。

第31页，课件共77页，创作于2023年2月4.像素与分辨率

像素是构成图像的最小单元，即图像上不同颜色或灰度的点，这些点组合起来形成一幅完整的图像。在CCD上为CCD的最小感光单元，其大小通常在几个微米到十几个微米，通过成像公式可换算成检测芯片上对应区域的大小。对于激光系统，像素的大小为激光光斑的尺寸，可以通过改变光斑直径来改变像素的大小。分辨率是指能够区分的最近两个点的最小距离。像素的大小决定了分辨率的高低，像素越大，分辨率越高，分辨率越高则图像越清晰，定量的准确度就越高，可以提供更精细的具有统计意义的数据。第32页，课件共77页，创作于2023年2月像素与分辨率激光系统扫描仪的分辨率主要是由激光的聚焦直径决定的，分辨率一般为5～10μｍ。CCD系统扫描仪的分辨率主要决定于CCD像素的数目，一次成像型CCD扫描仪的分辨率一般为大于或等于20μm，多次扫描拼接成像型则可达2.5μm。第33页，课件共77页，创作于2023年2月第二节扫描仪简介控制和自动化系统是由电脑来完成的。图形化的操作界面使得初学者只需接受简单的训练或阅读操作手册就能够使用仪器，因此扫描仪使用者并不需要精通扫描仪的光学和电子学部分的原理控制软件具有许多自动设置功能，如不同的用户扫描不同样品可设置、保存、再现扫描参数；可自动设定2个以上的扫描激光波长并自动保存图像结果；对某一扫描波段自动调整灵敏度、激发光强度及探测器探测范围等。第34页，课件共77页，创作于2023年2月商品化生物芯片扫描仪

激光共聚焦扫描仪

—ScanArray系列、SureScan芯片扫描仪、DNAscope™

系列。激光非共聚焦扫描仪

—GenePix系列CCD基因芯片检测仪

—AlphaArrayTM

基因芯片扫描分析系统、GeneTAC扫描仪、SpotWare基因芯片扫描仪、ArrayWoRx“e”扫描仪国产扫描仪

—成都中科百奥科技有限公司SCAN-1、北京博奥生物芯片有限责任公司EcoSCANTM-100

第35页，课件共77页，创作于2023年2月扫描过程应注意的问题由于芯片扫描仪有极高的灵敏度和分辨率，芯片上很小的尘埃或杂质污染都会引起非常明亮的背景和噪音，因此在芯片的制作，杂交和清洗过程中都应在洁净的环境中进行，最好在洁净台或者洁净间操作，并注意防静电。芯片完成杂交和清洗后应尽可能立即扫描测定，防止荧光标记靶分子降解。杂交后的芯片应避免长期暴露在强光下，因而导致光漂白，影响测定结果。芯片扫描中由于有机械传动装置，因此仪器应放置在平稳坚固的平台上，并注意防止外源性震动。第36页，课件共77页，创作于2023年2月一、芯片图像的性状

灰度图最原始的图谱是黑白的，显现的是灰度值，一般扫描仪所得到的图谱为16位的Tif、Jpeg、Raw等格式的图像（也有些扫描仪能得到更高的24位的图像）第三节芯片图像处理每个像素的灰度值在0-65535之间的范围内，每个灰度值都反应了图像所对应芯片位置的荧光分子相对强度信息。第37页，课件共77页，创作于2023年2月伪彩图在扫描仪配套的扫描软件中一般都内建有能将原始的灰度图改为伪彩图的功能。由于肉眼对区分同种颜色的不同强度（灰度）并不敏感，因此就人为的将灰度值根据其数值大小转化成不同颜色，以便于肉眼观察扫描图谱时便能一目了然的区分出同一张芯片上各种基因的相对信号强弱。

第38页，课件共77页，创作于2023年2月叠加图对于基因表达谱芯片，为了便于扫描完毕就能大致判断芯片中是否有上调或下调的差异基因，有些扫描或分析软件中还提供叠加图的功能。它是将同一张芯片所对应的两种不同杂交样本扫描所得图谱分别转变成绿色和红色的图谱。一般对照样本（通常用Cy3标记）被转变为绿色，而实验样本（通常用Cy5标记）被转变为红色。当两张图谱叠加在一起时，每个基因点的最终色彩由两种颜色的比率而决定。第39页，课件共77页，创作于2023年2月如果点的颜色为红色，说明该基因在实验样本中的表达量比对照样本中的表达量高，该基因为上调基因；如果最终基因点的颜色为绿色，则该基因在实验样本中的表达量比对照样本中的表达量低，该基因为下调基因；如果最终基因点的颜色为黄色，该基因没有显著变化。第40页，课件共77页，创作于2023年2月第41页，课件共77页，创作于2023年2月多Block的芯片芯片图像上的点象格子一样排列。有些芯片的图像还包括几个部分，每个部分含有相同行和相同列的点的子格，并且每个子格之间的距离大概相等，所有的子格合在一起就是一整张芯片。第42页，课件共77页，创作于2023年2月理想的芯片图像1）所有子格大小相同。2）子格之间距离相等。3）子格中行和列之间的距离相等。4）点中心的位置应在行线和列线的交点处。5）点的形状是个圆，并且所有圆的大小相同。6）片子上没有灰尘或者其他污染。7）图像背景均一而且值很小。实际情况和这种理想情况往往有很大偏离。

第43页，课件共77页，创作于2023年2月实际的偏离点位置偏移：原因在于芯片生产过程中的机械方面。每个点之间的间隔可能会不一致。另外还有机器人系统，点样仪器的不精确和放置片子的托盘的稳定性不好，还有一些点位置不易确定。点大小和形状不规则：点样时DNA溶液的液滴大小不同，导致点的大小也不同。另外，液滴中DNA浓度和盐的浓度不同，点的形状可能与圆相差很大。在一个点所对应的圆内，各处DNA密度也不尽相同。污染：灰尘的污染，样品中核酸、蛋白质、细胞和组织碎片的污染，扫描得到的图像有的并不“干净”，存在较大的杂质亮点或者部分区域的污染。全局性的因素：片子本身的不均匀性，芯片表面烘干时的不均匀以及芯片扫描仪本身存在的系统噪音第44页，课件共77页，创作于2023年2月ArrayGene软件图像处理第45页，课件共77页，创作于2023年2月第46页，课件共77页，创作于2023年2月第47页，课件共77页，创作于2023年2月第48页，课件共77页，创作于2023年2月第49页，课件共77页，创作于2023年2月第50页，课件共77页，创作于2023年2月第51页，课件共77页，创作于2023年2月第52页，课件共77页，创作于2023年2月二、芯片图像的处理

样点的识别和位置的确定确定样点的大概位置通常的做法是根据芯片阵列的行和列的数目(一般会由芯片制造者事先给定)，由计算机自动生成一个网格（gridding），每个格对应一个样点，这个网格为每个点提供了一个相对位置的坐标。其次还要对网格进行定位，确定网格在图像上的位置。在网格生成之后，还得对样点进行识别。有的图像处理软件在网格交点出设计一个圆，每个圆套住一个样点。有的设计成方格形，然后在方格内再产生一个圆，每个圆套住一个样点。实际上芯片样点的大小并不一致，因此有些软件会根据特定的计算方法逐步调节圆的位置和大小，使圆正好能套住样点。第53页，课件共77页，创作于2023年2月第54页，课件共77页，创作于2023年2月样点的识别和位置的确定整个芯片图像可能是由好几个块组成，各个子块的位置可能还需要微调。有时候片子中图像有些歪斜，而计算机生成的网格是横平竖直的，需要将片子旋转，旋转的角度也是一个重要参数。第55页，课件共77页，创作于2023年2月手动定位：网格生成步骤中，用户可以手动将格子框架放到图像中，并可以调整网格，使之与样点能尽量对齐。由于图像中的点的间隔并不均一，用户可能要逐条调整网格线，使之与点对齐。一个芯片图像有成千上万个样点，手动定位非常费时费力；对样点间隔不均一的片子和样点大小差别很大的片子，人为的错误会带来很大的误差。第56页，课件共77页，创作于2023年2月半自动定位：

用户可能需要将格子覆盖在图上，调整格子大小，使之与点的位置大致匹配，或者需要告诉程序图像中格子的四个角。算法就能自动的调整格子线，和各个点，从而来定位样点节省时间；即便信号强度很弱，也能识别出来。在点之间间隔不均一的情况下也能很好的识别信号点；能正确识别真正信号点旁边的污染物第57页，课件共77页，创作于2023年2月自动定位

图像处理的最终目的：建立一个完全自动的方法，能利用成熟的计算机图像识别算法，在不需要任何人工干预的情况下识别信号点。BioDiscovery公司已经发展了一个AutoGene工具。这个工具只需要用户事先定好片子的一些参数（就是，行和列的数目），它将自动的在图像中找到正确的网格位置。极大的减少人工干预，最大限度的减少由于人工参与而带来的误差，保证了数据的质量。

第58页，课件共77页，创作于2023年2月2.图像的分割(Segmentation)

计算机可视化术语。指确定属于前景（信号）（foreground）和背景（background）的像素在信号点定位之后，点和点周围的一部分区域内的像素就用来计算背景和前景强度。方法（按照像素的信息）可以分为三类：基于像素空间位置的分割；基于像素强度的分割；综合像素强度和空间信息的分割。SignalBackground第59页，课件共77页，创作于2023年2月基于像素空间位置的分割利用信号点定位结果的空间信息来分开属于信号的像素和属于背景的像素。相应位置上的圆将信号和背景分开。圆内的像素是信号，而圆外则是背景。这种方法已经被许多图像分析工具所采用，适合快速且粗略的分析图像数据。但是，在许多芯片图像中点的大小和形状都是不规则的，而且污染也大量存在，这种情况下，用这种方法分割会带来很大的误差，不能保证足够的准确性。第60页，课件共77页，创作于2023年2月按照信号点几何形状的三种分割方法固定圆分割可调圆分割FixedcircleScanAlyze,GenePix,QuantArrayAdaptivecircleGenePix,DappleAdaptiveshapeSpot,regiongrowingandwatershedHistogrammethodImaGene,QuantArraymDeArrayandadaptivethresholding可调形状分割第61页，课件共77页，创作于2023年2月基于像素强度的分割

所有像素按强度由小到大排列。假如不存在污染的话，强度值大的就认为是信号点像素。柱状图法：用一个框架（mask）包含相应点，在框架内的像素强度就形成一个柱状图。当像素强度值大于一个阈值的时候，这些像素就可以认为是前景值，反之，则认为是背景值。简单而且速度快得到的前景像素往往不相连，对于噪音大的点和弱信号点这种方法不适合BkgdForegroundBackground:meanbetween5thand20thpercentileForeground:meanbetween80thand95thpercentile第62页，课件共77页，创作于2023年2月综合像素强度和空间信息的分割

在信号点位置画一个大小适合的圆，圆内的像素暂时先认为是信号，圆外认为是背景。计算两个区域中像素强度的统计上的差异，并进行比较来分割出信号。Mann-Whitney检验法和修剪法。第63页，课件共77页，创作于2023年2月Mann-Whitney检验法

根据背景像素的统计性质来确定在圆内哪些像素是信号，Mann-Whitney检验法用来确定强度水平的阈值。圆内像素的强度超过这个阈值就认为是信号。圆内存在污染的时候，这些污染的像素也会被认为是信号。假如在圆外有污染的像素或者点的位置没有准确地确定以至于一些信号的像素在圆外面，这些高亮度的像素会提高阈值水平，在圆内的一些强度低的信号像素也会被归类成背景像素。处理噪声大的片子和弱信号点时候，效果不是很好。

第64页，课件共77页，创作于2023年2月修剪（trimmedoff）法

由于信号点的不规则，在圆外可能有一些像素是信号，在圆内也有一些像素是背景。污染的像素也是误差点。为了消除这些误差点的影响，可以简单地修剪掉（trimoff）一部分信号和背景像素。圆内像素强度分布函数的高端一定百分比的像素，由于这些像素很可能是污染，被修剪了；而低端一定百分比像素，由于这些像素很可能是背景，也被修剪掉了。这个方法的最大优势是能去除误差点的影响，但是准确度可能会下降，