基因工程及其在医学中的应用

基因工程及其在医学中的应用1第1页，课件共74页，创作于2023年2月第一节

基因工程2第2页，课件共74页，创作于2023年2月目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——将体外分离或人工合成的DNA与载体DNA连接，形成重组DNA，然后转化细菌或转染真核细胞宿主，通过筛选得到能表达重组DNA的活细胞，纯化后，稳定地扩增、传代和表达。基因工程的概念

3第3页，课件共74页，创作于2023年2月基因工程基本原理4第4页，课件共74页，创作于2023年2月基因工程操作流程①载体的构建和选择；②目的基因的制备；③限制性内切酶酶切载体和目的基因形成相匹配的接口；④DNA连接酶连接载体和目的基因；⑤重组DNA转化入细胞；⑥扩增；⑦筛选和鉴定重组子；⑧表达，纯化蛋白5第5页，课件共74页，创作于2023年2月基因工程载体制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。

载体：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。6第6页，课件共74页，创作于2023年2月基因工程载体的一般要求①能够自我复制，产生大量拷贝，装载目的基因后使后者能得到大量扩增；②载体DNA在提纯分离中容易和宿主细胞的染色体DNA分开；③本身分子量较小，容易操作，可装载较大分子量的目的基因；④具有多个单一限制性内切酶酶切位点，便于目的基因的插入；⑤含有一个或多个筛选标记，目的基因插入、转化细菌后可以通过抗生素抗性、营养缺陷或显色表型反应等进行筛选；⑥稳定地在子代细胞中复制或表达。7第7页，课件共74页，创作于2023年2月8第8页，课件共74页，创作于2023年2月载体分类按载体来源分为:质粒噬菌体病毒按载体用途分为:克隆载体表达载体按载体的宿主细胞分为:原核克隆/表达载体真核克隆/表达载体9第9页，课件共74页，创作于2023年2月1.质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。10第10页，课件共74页，创作于2023年2月目录11第11页，课件共74页，创作于2023年2月pUC18/1912第12页，课件共74页，创作于2023年2月λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列13第13页，课件共74页，创作于2023年2月14第14页，课件共74页，创作于2023年2月病毒载体质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用包括：如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转入病毒载体、慢病毒载体以及用于昆虫病毒表达的杆状病毒载体等。15第15页，课件共74页，创作于2023年2月目的基因的获取人工合成基因文库cDNA文库PCR扩增16第16页，课件共74页，创作于2023年2月条件：已知目的基因核酸序列或蛋白质序列。基因较小人工合成17第17页，课件共74页，创作于2023年2月人工合成基因的局限性长度有限密码子兼并性二级结构影响拼接费用较高18第18页，课件共74页，创作于2023年2月二、基因组文库的构建应用核酸的分离纯化技术，直接从生物体组织和细胞中将全部DNA提取出来，然后用限制性内切酶随机地将DNA酶切成20kb~40kb或更大的数以万计的片段。将所有的片段与同一类载体连接重组，得到数以万计的重组体，再全部转化入宿主细胞进行扩增和保存。这种含有所有DNA克隆的混合体就是基因文库。需要制备目的基因时，可以通过探针或其他技术将所需的目的基因从基因文库中“钓”出来。19第19页，课件共74页，创作于2023年2月

三、cDNA文库的构建

以mRNA为模板，经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。20第20页，课件共74页，创作于2023年2月cDNA文库的构建：21第21页，课件共74页，创作于2023年2月

22第22页，课件共74页，创作于2023年2月

基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。

cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的DNA。23第23页，课件共74页，创作于2023年2月四、聚合酶链式反应（PCR）

24第24页，课件共74页，创作于2023年2月PCR基本原理N=N0(1+e)n

25第25页，课件共74页，创作于2023年2月PCR反应体系

模板（template）引物(primer)DNA聚合酶(DNApolymerase)dNTPPCRbuffer26第26页，课件共74页，创作于2023年2月PCR热循环

94℃,300S

94℃,60S

30

55℃,60S

72℃,60S

（举例）72℃,7min

27第27页，课件共74页，创作于2023年2月载体DNA与目的基因的连接28第28页，课件共74页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。29第29页，课件共74页，创作于2023年2月BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口30第30页，课件共74页，创作于2023年2月DNA连接酶1、大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端2、T4DNA连接酶：既能连接粘性末端，又能连接平末端31第31页，课件共74页，创作于2023年2月DNA连接酶作用模式图32第32页，课件共74页，创作于2023年2月1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接33第33页，课件共74页，创作于2023年2月BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录第34页，课件共74页，创作于2023年2月不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录第35页，课件共74页，创作于2023年2月同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。36第36页，课件共74页，创作于2023年2月5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录第37页，课件共74页，创作于2023年2月人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

38第38页，课件共74页，创作于2023年2月人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录第39页，课件共74页，创作于2023年2月2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端40第40页，课件共74页，创作于2023年2月目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录41第41页，课件共74页，创作于2023年2月重组DNA分子引入受体细胞转化转染感染42第42页，课件共74页，创作于2023年2月一、转化外源DNA进入细胞（常指原核细胞如细菌）而使遗传性改变称为转化。指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。

DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。43第43页，课件共74页，创作于2023年2月二、转染指病毒或以它为载体构建的重组子（非包装形式）导入受体细胞的过程。44第44页，课件共74页，创作于2023年2月三、感染噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染（infection）。用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。感染的效率很高，但DNA包装成噬菌体或病毒的操作较麻烦。45第45页，课件共74页，创作于2023年2月重组体的筛选和鉴定46第46页，课件共74页，创作于2023年2月一、遗传标记筛选1.最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（ampr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。47第47页，课件共74页，创作于2023年2月48第48页，课件共74页，创作于2023年2月(插入失活法)抗药性标记选择第49页，课件共74页，创作于2023年2月2.营养缺陷型的互补筛选二氢叶酸还原酶(DHFR)基因缺陷α互补筛选50第50页，课件共74页，创作于2023年2月DHFR缺陷型CHO无胸腺嘧啶的培养基二氢叶酸还原酶(DHFR)基因促进THF合成λDNA重组体遗传互补第51页，课件共74页，创作于2023年2月α互补的检测第52页，课件共74页，创作于2023年2月53第53页，课件共74页，创作于2023年2月二、酶切鉴定54第54页，课件共74页，创作于2023年2月三、核酸分子杂交法

55第55页，课件共74页，创作于2023年2月四、免疫鉴定利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。56第56页，课件共74页，创作于2023年2月五、PCR法57第57页，课件共74页，创作于2023年2月六、核苷酸序列测定58第58页，课件共74页，创作于2023年2月重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交第59页，课件共74页，创作于2023年2月目的基因的表达原核基因表达体系真核基因表达体系60第60页，课件共74页，创作于2023年2月原核表达载体强启动子强终止子启动子必须受控制起始密码子与SD序列有合适距离蛋白选择标记具复制原点、多克隆位点61第61页，课件共74页，创作于2023年2月原核细胞重组蛋白的表达、分离和纯化62第62页，课件共74页，创作于2023年2月真核表达体系优点：转录后加工翻译后加工缺点：操作麻烦费用较高重组