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文档简介
体外受精与核移植动物第1页,课件共73页,创作于2023年2月体外受精与核移植动物第2页,课件共73页,创作于2023年2月13.1胚胎工程胚胎工程(embryotechnology)是指对动物早期胚胎或配子进行工程操作,获得所需要的成体动物的技术。胚胎工程技术主要包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割与融合、胚胎与精子、卵子冷冻、保存、胚胎性别控制、胚胎细胞核移植、基因导入等。第3页,课件共73页,创作于2023年2月13.2体外受精动物体外受精动物的概念体外受精动物的意义体外受精动物的培育程序第4页,课件共73页,创作于2023年2月体外受精技术的发展20世纪60年代初至20世纪80年代中期,人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料,进行了大量基因注射显微操作图。基础研究,在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。第5页,课件共73页,创作于2023年2月
这些理论和方法上的成就,推动了体外受精技术的发展,试管小鼠(Whit-tingham,1968)、大鼠(Toyoda和Chang,1974)、婴儿(Steptoe和Edwards,1978)、牛(Brackett等,1982)、山羊(Hamda,1985)、绵羊(Hanada,1985)和猪(Chang等,1986)等相继出生。第6页,课件共73页,创作于2023年2月体外受精动物的概念:
体外受精(invitrofertilization,IVF)是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。体外受精动物也称试管动物(test-tubeanimal)是指将供体的精子和卵子在体外受精,体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。第7页,课件共73页,创作于2023年2月体外受精动物的意义:发挥优良母畜的繁殖潜力促进家畜改良的速度保存遗传资源辅助技术第8页,课件共73页,创作于2023年2月体外受精动物培育的程序精子采集与体外获能卵子采集与成熟培养体外受精重组胚激活与体外培养胚胎移植体内发育、出生第9页,课件共73页,创作于2023年2月精子采集与体外获能1.采集精子并选择有活力的精子上浮分离法:在精液中加入少量培养液,有活力的精子会游到培养液上部。这样收集培养液上面的精子即可得到有活力的精子。2.精子获能是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。目前可以采用添加诱导精子获能物质(如钙离子、血清蛋白、肝素)的特定培养液来完成精子体外获能。
第10页,课件共73页,创作于2023年2月卵细胞回收与成熟培养卵细胞的回收(1)超数排卵(2)从活体卵巢中采集卵母细胞(3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞第11页,课件共73页,创作于2023年2月(1)超数排卵
对于实验动物如小鼠、兔,以及家畜猪、羊等采用的主要方法是;用促性腺激素处理,使其排出更多的卵子,然后,从输卵管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。在大家畜中,由于操作程序复杂,成本较高,很少使用。这种方法的关键是掌握卵子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精能力的时间,一般要求在卵子具有旺盛受精力之前冲取。第12页,课件共73页,创作于2023年2月(2)从活体卵巢中采集卵母细胞
这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。在家畜中,牛和马等大家畜常用超声波探测仪辅助取卵,其方法是用手从直肠把握卵巢,经阴道壁穿刺插入吸卵针,借助B型超声波图像引导,吸取大卵泡中的卵母细胞。按照目前的技术水平,一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。在家畜中,活体采集的卵母细胞一般要经成熟培养后才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母畜具有重大意义,在有些国家已用于商业化生产。第13页,课件共73页,创作于2023年2月(3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞
这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢,经洗涤、保温(30℃~37℃)后,快速运到实验室,在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞(牛卵泡直径要求3-10mm)也可对卵巢进行切片,收集卵母细胞。用此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期(GV期),需要在体外培养成熟后才能与精子受精。从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的保温和防止细菌污染。因此卵巢从畜体摘取后须放入含有生理盐水或磷酸缓冲液(PBS)的保温瓶中;吸卵前卵巢要用生理盐水或PBS多次洗涤;所用溶液都要添加抗生素。这种方法的最大优点是材料来源丰富,成本低廉,但确定母畜的系谱困难。
第14页,课件共73页,创作于2023年2月
第15页,课件共73页,创作于2023年2月母细胞的选择
采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体(cumulusoocytecomplesxCOC)。无论采用何种方法,采集的COC都要求卵母细胞形态规则,细胞质均匀,外围有多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中,常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围,细胞质均匀;B级要求卵母细胞质均匀,卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞;C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞;D级是死亡或退化的卵母细胞。在体外受精实践中,一般只培养A级和B级卵母细胞。第16页,课件共73页,创作于2023年2月
第17页,课件共73页,创作于2023年2月卵母细胞的成熟培养
由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟,不需培养可直接与精子受精,对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。培养时,先将采集的卵母细胞在实体显微镜经过挑选和洗涤后,然后放入成熟培养液中培养。通常采用微滴培养法,微滴体积为50-200微升,每滴中放入的卵母细胞数按每5微升一个计算单位。卵母细胞移入小滴后,放入CO2培养箱中培养,培养条件为39℃、100%湿度和5%二氧化碳的空气。牛的培养时间为20-24小时,卵丘卵母细胞复合体经成熟培养后,卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列,出现放射冠,用DNA特意性染料染色后,在显微镜下进行核相观察,可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。第18页,课件共73页,创作于2023年2月卵母细胞成熟的一些标志
生发泡破裂、染色体凝集、纺锤体形成、极体排出、透明带软化、卵丘细胞扩散等。用DNA特异性染料染色后在显微镜下进行核相观察,可见卵母细胞处于第二次成熟分裂中期。第19页,课件共73页,创作于2023年2月第20页,课件共73页,创作于2023年2月体外受精一共培养体外受精受精卵是否可以发育至囊胚是受精成功的标志第21页,课件共73页,创作于2023年2月二显微受精技术(辅助受精技术)辅助受精技术(Techniquesf.rassistedfertilizati.n)是IVF的延伸,它是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程,克服在某些情况下精子不能穿过透明带和卵黄膜的缺陷。这项技术起源于20世纪60年代,20世纪80年代得到迅速发展,在医学上已成为治疗某些男性不育症的主要措施之一;在基础生物学中,它对研究哺乳动物受精和发育机理有很重要的价值;它还对挽救濒危动物和充分利用优良种公畜等有重要意义。目前哺乳动物的辅助受精技术有透明带修饰和精子注人两种方法。由于两种方法都需要借助显微操作仪来完成,所以又称辅助受精技术为显微授精(microinsemination)。第22页,课件共73页,创作于2023年2月辅助受精两种方法透明带修饰法
精子注入法第23页,课件共73页,创作于2023年2月透明带修饰法
它是运用物理或化学方法对卵母细胞的透明带进行打孔、部分切除或撕开缺口,为精子进入卵黄周隙打开通道,然后把卵子与一定浓度的精子共培养以完成受精过程.这种方法适用于具有一定运动能力,但顶体反应不全,无法穿过透明带的精子。它的优点是对卵子的损伤小,但对于靠透明带反应阻止多精入卵的动物易造成多精子受精,影响胚胎继续发育。目前这种方法仅在小鼠中取得成功。
第24页,课件共73页,创作于2023年2月精子注入法
它是利用显微操作仪直接把精子注入卵黄周隙或卵母细胞的胞质中,前者称透明带下授精(subzonalinseminatiomSUZI),后者称胞质内精子注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)。透明带下授精对注入的精子数有严格要求:具有活力且已发生顶体反应的精子要单个注入;没有发生顶体反应的精子,注入的数目可加大。SUZI的优点是对卵母细胞的损伤小,已在临床医学上得到运用,但多精入卵是制约这一技术发展的主要原因。胞质内精子注射对精子活力、形态和顶体反应没有特殊要求,只需注入单个精子即可,为提高受精率,注射后卵子需要人为激活。第25页,课件共73页,创作于2023年2月胚胎培养受精卵在体外培养发育至桑葚期或囊胚期才能进行移植。通常情况下,移植的较佳时期是发育至8~16细胞期的胚胎。发育阻滞:是指体外受精的早期胚胎在体外发育中往往会停止在某一阶段不再发育,这种现象称为发育阻滞。提高受精卵发育率的关键因素:是选择理想的培养体系。在家畜中,胚胎培养液分为复杂的和化学成分明确的培养液两大类。复杂培养液中的成分很多,除无机和有机盐外,还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清,最常用的有TCM199、B2和F10。用它们培养胚胎时,可以采用体细胞共培养体系,即体细胞与胚胎在微滴中共同培养,利用体细胞生长过程中分泌的有益因子,促进胚胎发育,克服发育阻断。第26页,课件共73页,创作于2023年2月胚胎移植
胚胎移植(embryotransfer,ET)是指将发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜卵管或子宫的技术。胚胎移植应选择与供体发情周期同步、生殖道正常、无疾病、繁育史良好的受体。通常采用药物调控发情期的方法,来刺激或抑制动物的生理周期,从而达到动物发情的同步化。第27页,课件共73页,创作于2023年2月胚胎移植的方法手术法适用对象:绵羊等小家畜一般采用手术法移植操作过程:将同期发情的受体动物仰面固定在手术床上,全身麻醉,借助内窥镜观察排卵和黄体发育情况。腹部切口,将一侧卵巢上有黄体发育的子宫远端拉出,吧胚胎输入子宫上1/3处。也可先用钝形针头在要移植部位刺一个小孔,然后吧吸有胚胎的胚胎移植管插入穿刺孔,小心将胚胎输入。第28页,课件共73页,创作于2023年2月2.非手术法
使用对象:对于牛、马等大家畜经常采用非手术法。操作方法:一般使用专用胚胎枪直接插入子宫内注入胚胎。第29页,课件共73页,创作于2023年2月13.3试管婴儿试管婴儿:(test-tubebaby)是指卵子与精子在体外受精,培养发育成早期胚胎,再植回受体子宫内发育出生的婴儿。1978年,世界首例试管婴儿在英国诞生。1983年,澳大利亚培育出第一例人类冷冻胚胎试管婴儿。1988年,我国首例常规试管婴儿在北京医科大学诞生。2000年,我国首例超快速冷冻胚胎移植的试管婴儿在湖南医科大学诞生。第30页,课件共73页,创作于2023年2月二、试管婴儿
世界上第1例试管婴儿LouisBrown在英国诞生第31页,课件共73页,创作于2023年2月中国双胞胎试管婴儿第32页,课件共73页,创作于2023年2月试管婴儿可分为三个类型:第一代试管婴儿:
1977年,爱德华兹(Edwards)和斯蒂普特(Steptoe)培育为第一代试管婴儿。第33页,课件共73页,创作于2023年2月第二代试管婴儿:1992年,Palermo的单精子卵细胞浆内注射(ICSI)是第二代试管婴儿通过先进的显微注射仪将单个精子注射进卵子内受精培育的婴儿,因此这种方法又称为显微受精第二代试管婴儿的技术关键在于显微操作系统与注射技术的建立等第34页,课件共73页,创作于2023年2月第三代试管婴儿:通过种植前遗传学诊断(PDG)技术培育出的试管婴儿将被称为第三代试管婴儿从体外受精的胚胎取出部分细胞进行基因诊断,排出带致病基因的胚胎后再进行移植,从而实行胚胎着床前即诊断出遗传病症的愿望1990年,世界首例PDG试管婴儿成功培育第35页,课件共73页,创作于2023年2月第四代试管婴儿:借助别人卵浆增强自己卵子能力特征:卵浆置换只要针对那些卵子质量不高、活力差的高龄女性第36页,课件共73页,创作于2023年2月试管婴儿(第一代)技术步骤女方超排卵与取卵精子采集与体外获能处理体外受精受精卵体外培养胚胎移植胚胎移植(选择8细胞胚胎)与观察子宫内发育、婴儿诞生第37页,课件共73页,创作于2023年2月13.4核移植动物核移植:(cellnucleartransfer)是利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟细胞内的技术。细胞核移植动物:又称为克隆动物(clonedanimal),是指用特定发育阶段的核供体及相应的核受体(去核的成熟卵细胞)体外构建重组胚,通过胚胎移植到受体完成发育出生的动物。细胞核移植动物又称为核质杂种,包括胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物。第38页,课件共73页,创作于2023年2月13.4.1核移植动物培育流程:1.核供体细胞获得与取核供体核细胞可以使原代细胞或传代细胞,从来源上包括胚胎细胞、胚胎干细胞、体细胞。分离制备单个动物细胞,通常采用处于G0期细胞作为核移植的供体细胞。
第39页,课件共73页,创作于2023年2月⑴胚细胞用0.2%链霉蛋白酶预处理胚胎,溶去胚胎的胶膜及透明带,分离出单个卵裂球。消化透明带的时间是影响卵裂球质量的重要因素,作用时间短,透明带不能充分消化,卵裂球不易获得;作用时间长,则影响到卵质膜,容易破裂,在操作时容易失败。因此,在分离卵裂球时应在解剖镜下监视透明带的消化过程,当透明带变薄,膨胀适度时就应移出,再用适当口径的吸管吹打使之分离。另外,苏格兰学者Campbell等显微分离胚盘细胞并在体外进行缺血饥饿传代培养,诱使细胞处于“静止”状态,以便调整染色体结构,从而有助于核的重组与发育,他们使用这种方法建立了绵羊TNT4细胞系,该细胞形态类似于胚胎干细胞,但更扁平、上皮化。第40页,课件共73页,创作于2023年2月
⑵体细胞
最早用青蛙肠粘膜上皮细胞获得了后代。Wilmut等用绵羊乳腺细胞获得Dolly羊。美国夏威夷大学RyuzoYanagimachi教授领导的一个国际科研小组于1998年以小鼠卵丘细胞为核供体,采用吸移管注入,利用机械和化学激活方式进行细胞的融合,成功培育三代克隆小鼠。对小鼠、牛体细胞移植的相关研究中发现休眠(G0)的颗粒细胞核与去核MⅡ期卵母细胞构成的体细胞重构胚,其发育率及产生克隆后代的能力远高于其它类型的休眠体细胞,这可能缘于颗粒细胞上存在着与卵母细胞紧密联系的胞质微绒毛桥的缘故,它或许有助于供体核同受体核胞质因子的交换。第41页,课件共73页,创作于2023年2月细胞核移植所用受体细胞一般采用MⅡ期成熟卵细胞,可以从动物体内直接获得,但数量有限。目前,高质量的体外成熟(IVM)培养的卵细胞可以替代体内成熟卵细胞进行核移植。
2.受体细胞去核第42页,课件共73页,创作于2023年2月受体细胞去核方法:⑴盲吸去核法:
用细胞骨架抑制剂——细胞松弛素B或秋水仙处理卵细胞,使细胞骨架松弛。用固定管在第二极体对面吸引固定卵细胞,将外径25~30um的尖头管轻轻刺入透明带,停在第二极体附近的卵周隙中,轻轻将去核管连同其中的内容物拉出透明带,完成卵细胞去核。随后将去核管内的核驱出。去核后的卵细胞用培养液洗涤后继续培养1~2h,用作细胞核移植受体。可以用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色,在紫外观察下去核可提高去核成功率。第43页,课件共73页,创作于2023年2月
⑵功能性去核法:
通过用紫外线或激光照射使染色体失活而达到去核目的。第44页,课件共73页,创作于2023年2月⑶化学诱导去核:
用脱羧秋水仙碱处理激活的小鼠MⅡ期卵细胞使其排放弟二极体。由于脱羧秋水仙碱的作用,核染色质没有分开而全部进入第二极体。这样就可完成去核。这种方法可以在同一时间大量去核,同时还避免了人为操作的不稳定性,这使哺乳动物克隆技术大为简化。第45页,课件共73页,创作于2023年2月3.细胞核移植核移植方法:⑴直接注射法利用较细的注核针抽吸核供体细胞使核膜破裂,吸入供体核后,直接刺破受体卵质膜,将核直接注入卵周隙,完成细胞核移植。然后逐渐减少固定吸管的负压放开重组胚。第46页,课件共73页,创作于2023年2月⑵透明带下注射法
用核针将供体卵裂球或细胞核直接移至去核卵细胞的卵周隙,使供体核进入受体卵胞质内,形成重组胚。第47页,课件共73页,创作于2023年2月4.重组胚激活
激活的方法:⑴电激活对已融合重组胚或胞质内注射的重组胚给予电刺激,使重组胚充分激活。第48页,课件共73页,创作于2023年2月⑵化学激活
单独使用化学激活剂可对重组胚激活。化学激活使用的激活剂包括7%乙醇、离子霉素、钙离子载体A23187等。第49页,课件共73页,创作于2023年2月5.重组胚培养和移植
⑴体外培养:将重组胚在特定培养液中培养为桑葚或胚囊胚,选择优质胚胎移入同种的同期发情的受体中继续发育。培养48h检查重组胚的卵裂率,并观察检查,记录桑葚胚及囊胚发育率。第50页,课件共73页,创作于2023年2月⑵体内培养:
将重组胚植入同种或异种动物的输卵管中发育为桑葚或胚囊胚,然后进行胚胎移植。第51页,课件共73页,创作于2023年2月13.4.2胚胎细胞克隆动物第52页,课件共73页,创作于2023年2月13.4.3体细胞克隆动物真正意义上的克隆
——历程碑式的突破第53页,课件共73页,创作于2023年2月
罗斯林研究所科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞,将细胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中,使之融合、分裂、发育成胚胎,然后移植到第三头羊的体内。科学家共培育277个胚胎,只有多莉成功出生。1996年7月5日,多莉降临人世。直到1997年2月23日才公布于众。第54页,课件共73页,创作于2023年2月体细胞克隆的应用与意义
1、检验动物细胞全能性2、加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物3、利用转基因克隆动物进行生物药物的生产4、异种器官移植(结合特异基因的敲除)5、治疗性克隆(可以用患者本人细胞培育出新组织)第55页,课件共73页,创作于2023年2月2001年8月7日,美国科学院关于克隆人问题的讨论会上,三位表示要克隆人的科学家。左:意大利国际联合研究所所长SeverinoAntinori中:克隆援助(Clonaid)公司老板BrigitteBoisselier右:美国肯塔基大学教授PanayiotisMichaelZavos他们克隆人的目的都是为了给不孕的夫妇培育后代。科学三狂人克隆三疯子第56页,课件共73页,创作于2023年2月第57页,课件共73页,创作于2023年2月思考:
现如今克隆已经取得了很大的成就,那它的继续发展将会给我们这个现存的社会会带来什么影响?你是否可想过如果有一天你和你的复制人一起生活呢?
……
思考才回创造哟!第58页,课件共73页,创作于2023年2月13.5冷冻保存技术保证了人工受精、胚胎移植等不受环境、地点和时间等因素的限制。为建立优良动物的胚胎库提供了可能。第59页,课件共73页,创作于2023年2月15.5.1胚胎冷冻保存非冷冻保存:胚胎冷藏保存法:一般在0~4℃左右保存冷冻保存法:是指-196℃保存胚胎冷冻保存为建立优良品种的胚胎库提供了条件,同时也便于胚胎的运输与移植。第60页,课件共73页,创作于2023年2月胚胎冷冻保存抗冻保护剂的选择⑴渗透型冷冻保护剂属于细胞内冷冻保护剂,一般为小分子物质,在0℃以上很容易通过细胞膜进入细胞质。常见的渗透型冷冻保护剂有甘油,二甲基亚砜,丙二醇和乙二醇。第61页,课件共73页,创作于2023年2月⑵非渗透型冷冻保护剂
属于细胞外冷冻保护剂,一般为大分子物质,能够溶解于水,但不能进入细胞内。常见的非渗透型冷冻保护剂包括单糖,二糖,三糖,聚乙烯吡咯烷酮等。第62页,课件共73页,创作于2023年2月胚胎冷冻保存冷冻方法:(一)程序冷冻与复苏
是目前胚胎冷冻最常用的方法之一。所用冷冻保护剂一般为二甲亚砜,氨基酸,丙三醇,1,2—丙二醇等影响因素包括:抗冻保护剂的选择与浓度,植冰河降温速度,解冻方法,抗冻剂的脱除等。第63页,课件共73页,创作于2023年2月
大致步骤如下:⑴将采集到的胚胎在含20%小牛血清的PBS溶液中洗涤2次。⑵将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol/L甘油和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡20min。⑶将胚胎和冷冻液装入0.25mL胚胎冷冻细管中,封口,并在细管外标记供体号,胚胎数量,等级,冷冻日期等。第64页,课件共73页,创作于2023年2月⑷将装入胚胎的细管放入冷冻仪中,在0℃平衡10min,以1℃/min的速度降至—7~—6℃,并在此温度下诱发结晶,平衡10min,然后以0.3℃的速度降温至—38~—35℃,投入液氮保存。⑸解冻时从冷冻液中取出装胚胎的细管,在空气中平衡10s,立即置于37℃水浴解冻,1min后取出完成解冻过程。⑹将细管中的冷冻液及配套推出,在显微镜下找到配套并移入解冻液。采用三步法解除甘油,每步5~7min,最后用PSB液将胚胎洗3~5遍,供移植备用。第65页,课件共73页,创作于2023年2月(二)玻璃化冷冻与复苏
玻璃化冷冻法不需要专门仪器,假如高浓度的抗冻液急速冷冻,由液体转化成透明胶状固体。玻璃化冷冻保护液组成一般为:20.5
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