基因克隆的相关质粒载体

载体通论（一）基本概念载体：在基因工程中，用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。（二）分类

克隆载体表达载体质粒载体噬菌体载体人工染色体按载体功能分按载体性质分在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆——克隆载体；在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达——转化载体或表达载体。常用基因工程载体有：细菌质粒(克隆)；λ噬菌体(克隆)；柯斯质粒(克隆)；穿梭质粒(克隆/表达)；细菌人工染色体(克隆/表达)；酵母人工染色体(克隆/表达)；Ti质粒及其衍生载体(转化)。表达体载体宿主第一代原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌第二代酵母表达体系穿梭质粒酵母第三代哺乳类细胞表达体系病毒、脂质体培养动物细胞第四代基因直接导入DNA本身生殖细胞、体细胞、个体（三）基因工程载体必须具备的条件：

※（1）有复制起点

※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点

※（3）具备合适的筛选标记

※（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化※表示载体必须具备的条件（四）基因工程中常用的载体

基因工程中常用的载体有5类：质粒（plasmid）单链DNA噬菌体M13噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus）质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征第一节质粒载体一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。大肠杆菌的质粒在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒又叫F因子或性质粒（sexplasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。（1）分子小：1.质粒的一般生物学特性1—200kb（2）编码基因少：2—3个中等大小的蛋白质。（3）环形状：双链环状DNA。（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；

2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；

3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（4）质粒的空间构型：（5）质粒空间构型与电泳速率在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC

DNA，其后依次是LDNA和OCDNASCOCL（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒:非接合型质粒能自我转移不能自我转移2质粒DNA的转移按接合转移功能分类主要基因按抗性记号分类非接合型质粒自主复制基因，产生大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)

接合型质粒自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段F质粒（F因子）自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Ent质粒除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。又叫自我转移型质粒。（1.1）接合型质粒不符合基因工程的安全要求。（2）F质粒(Fplasmid)又称F因子、致育因子或性因子，是大肠杆菌等细菌决定性别并有转移能力的质粒。分子量约为大小94kb，共编码19个转移基因。F质粒在寄主细胞中有三种存在形式：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带来自寄主染色体的基因或DNA区段。以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，携带着细菌的染色体基因或DNA区段。以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上。F质粒结构：tra区（转移区，与质粒转移和性菌毛合成有关）oriT（转移起始点）oriS复制起始点）inc（不相容群）rep（复制功能）转座因子根据F质粒在细胞中的存在方式，可把大肠杆菌分成四种不同接合型菌株。（1）F+菌株F+菌株即“雄性”菌株，指细胞内存在一至几个F质粒，并在细胞表面着生一至几条性菌毛的菌株。（2）F-菌株F-菌株即“雌性”菌株，指细胞中无F质粒、细胞表面也无性菌毛的菌株。（3）Hfr菌株（高频重组菌株）在Hfr菌株（高频重组菌株）细胞中，因质粒由游离态转为在核染色体组特定位点上的整合态，故Hfr菌株与F-菌株相接合后，发生基因重组的频率比单纯用F+与F-接合后的频率高出数百倍。（4）F’菌株当Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的、但携带整合位点邻近一小段核染色体基因的特殊F质粒，称F’质粒或F’因子。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌-雄细胞配对，这种过程称为细菌的接合作用（conjunction）。F因子DNA拷贝，需1分钟时间从雄性细胞转移到雌性细胞（3）质粒DNA的接合转移

①细胞交配对的形成雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速收缩，把给体细胞与受体细胞拉在一起。因此，性须在确立配对细胞表面间的紧密接触方面，起着至关重要的作用。

大肠杆菌雄性细胞是不会同其它的亦带有F质粒的细胞发生配对作用的，因为traS和traT编码的“表面排斥”蛋白质，使此种细胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只能同不具F因子的雌性细胞配对的特异性。

②质粒DNA的转移

F质粒DNA的转移是从转移起点oriT开始的。当细胞交配对建立之后，TraY和TraI蛋白质首先在oriT位点作单链切割，随后缺口链在其游离的5′-端的引导下转移到受体细胞，并作为模板合成互补链，形成新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为具有F因子的雄性细胞。2.非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。符合基因工程的安全要求。带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。（2）Col质粒：大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。

非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用（mobilization）。

ColE1是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。需要质粒自己编码的两种基因参与。一个是位于ColE1DNA上的特异位点bom；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即mob基因（mobilizationgene）编码的核酸酶。3质粒DNA的迁移作用相容性的两种质粒F和ColE1共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColE1质粒提供其所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1DNA便从超盘旋的的结构转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复，所以就出现这两种构型之间的平衡状态。（b）中的细胞同时含有F和ColE1两种质粒。F因子能够导致性须的合成，为其DNA转移提供了转移装置，因此ColE1可以被转移。而在F质粒提供的这种转移装置被分离掉的情况下，ColE1的mob-突变体便不能够转移。遗传分析证明，mob-突变是隐性的，mob基因编码一种蛋白质。而且当这种突变体质粒被分离出来时，并不是以松弛复合物的形式存在。（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已形成，但ColE1DNA并没有发生缺口。（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不能发生缺口，因此仍然不能够转移。4质粒DNA的复制类型1.低拷贝数的质粒拷贝数少，只有1—3份拷贝，也称为“严紧型”复制控制的质粒（stringentplasmid）2.高拷贝的质粒拷贝数多，有10—60份拷贝，也称为“松弛型”复制控制的质粒（relaxedplasmid）（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，将质粒分为低拷贝数的质粒和高拷贝数的质粒质粒拷贝数：每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子数目。质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型间存在一定的相关性。接合型质粒，分子量大，一般属严紧型非接合型质粒分子量小，一般属松弛型（1）质粒的不亲和性现象

所谓质粒的不亲和性（plasmidincompatibility），有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒

不亲和群（incompatibilitygroup），指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。

5质粒的不亲和性（2）质粒不亲和性的分子基础

质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。

大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环（negativefeedbackloop）。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制活动便被抑制；而当质粒处于低拷贝和低浓度遏蛋白质的条件下，它的复制反应便会继续进行。

由于每一种质粒的复制速率和拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。同一细胞中含有两种不相容的质粒，其产生的阻遏蛋白质不仅调节自身的复制，也会调节另一种与之共存的不相容质粒的复制一．质粒DNA复制的多样性不同质粒DNA的复制在如下几个方面存多样性：（i）对寄生酶的依赖性

有的完全利用寄主细胞所提供的核酸酶，有的自身也编码若干核酸酶，参加DNA复制（ii）DNA聚合酶的利用

多数利用polIII,有的质粒利用polI（iii）复制的方向性

有纯单向的，纯双向的，有既有单向又又双向的（iv）复制的终止

单向复制，在起点处终止复制双向复制，在复制叉到达同一位点时终止，或有一固定的终止位点（v）复制型

蝶状复制第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制ColE1质粒DNA的复制，是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环DNA分子单向性地进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNAⅡ两种RNA分子，都是由ColE1DNA转录产生的。RNAⅡ也叫做复制引物。RNAⅡ分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RnaseH酶所切割，从而释放出3′-OH末端，作为供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。RNAⅠ可以通过同RNAⅡ结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。

从本质上讲，ColE1质粒的复制启动显然是受一种负反馈机理控制的。根据这种模型，细胞中RNAⅠ分子的浓度是随着质粒拷贝数的多寡而增减的。例如，若细胞中质粒拷贝数下降到正常数值以下的水平，RNAⅠ的浓度也就相应降低，于是质粒的复制也就受到较少的抑制，结果导致其拷贝数的上升。二．ColE1质粒DNA复制的启动三．质粒复制控制的分子模型质粒DNA复制控制机理的分子模型有两种：自体阻遏蛋白质模型（autorepressormodel）：阻遏蛋白质的合成受负反馈（negativefeedback）机理调节，而且其浓度是恒定的。抑制蛋白质稀释模型（inhibitordilutionmodel）：阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。（1）抑制蛋白质稀释模型质粒DNA编码的抑制蛋白质同质粒DNA的复制起点（oir）结合阻断起始蛋白质Rep的合成细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比，它抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径1.质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质Rep引发的Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过同启动子-操纵基因区（P/O）的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Atr和Rep蛋白质处于恒定的水平。由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合，来引发质粒DNA的复制2.Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒DNA进行复制（2）自体阻遏蛋白质模型第三节质粒DNA的分离与纯化应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是要获得批量的纯化的质粒DNA分子。通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌细胞裂解的，绝大部分的染色体DNA分子都将以高分子量的形式释放出来，这样便可以应用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到了比较清亮的裂解液。一．氯化铯密度梯度离心法

在细胞裂解及DNA分离的过程上，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。

氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这一差别建立的纯化质粒DNA的经典技术。当将含有溴化乙锭（EtBr）的氯化铯（CsCl）溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，EtBr扁平分子便会通过在碱基对之间的嵌入作用而结合成DNA分子链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，例如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合相当大量的EtBr分子。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的结合数量相对较少。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。线性的或开环的DNA分子，可结合相当大量的EtBr分子，密度低共价闭合环状的质粒DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的结合数量相对较少，密度高通过氯化铯密度梯度离心，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

通过加热，在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，连接DNA互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。

线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。二．碱变性法

微量碱变性法具有简单快速、经济实惠的优点，是当前分子生物学及基因工程研究工作中最常用的一种分离纯化质粒DNA的方法

第一步，取1.5毫升含有质粒的大肠杆菌过夜培养物加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀，并用100微升冰冷的溶液I[50mM葡萄糖，25MmTris-HCl（Ph8.0），10MmEDTA，4～5mg溶菌酶/mL]重新悬浮。将反应混合物在室温下静置5分钟，让溶菌酶充分发挥效力，促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的pH值有很大的依赖关系，TrisHCl缓冲体系和适量的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸（EDTA），可抑制酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。

第二步，加入200微升冰冷的溶液Ⅱ[0.2NNaOH,1.0%SDS]，缓缓混匀后，置室温下5分钟。SDS的作用在于使细胞裂解，以释放质粒及染色体的DNA。在高pH值（12.0～12.5）的反应体系中，则会使线性缺口的质粒DNA以及线性的染色体DNA片段被选择性地变性，而共价闭合环状的质粒DNA则不会受影响。三．微量碱变性法第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸钠，缓缓震荡10秒钟后，放置在冰浴中5分钟。PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而使线性的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复合物形式沉淀出来，从而使质粒DNA得到纯化。第四步，将上述离心所得的主要是含有质粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提数次除去蛋白质污染物，最后按酒精沉淀法收集质粒DNA。

按照这种方法制备的质粒DNA，其纯度完全可以满足常规的基因克隆实验要求。如有必要亦可用凝胶过滤法作进一步的纯化。（1）寄主菌株的遗传背景

大肠杆菌寄主菌株的正确选择，是获得高产量质粒DNA的重要条件之下。建议使用endA基因发生突变的（endA1）大肠杆菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。四．影响质粒DNA产量的因素（2）质粒的拷贝数及分子大小

细菌培养物中质粒DNA之理论产量，可以根据公布的质粒的拷贝数和分子量大小（bp）及每毫升培养物中的大肠杆菌细胞总数三者相乘得出。质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因素之一。（1）分子量大，拷贝数低第四节质粒载体的构建1.天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。天然质粒,是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1RSF2124和pSC101等。ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。（2）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞…….colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。ColE1（1）具有复制起点（ORI）2.质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）3.质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记①抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号，包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多种。

常用抗菌素的抗性工作原理i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。a）抑菌原理b）细菌抗性原理Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。b）细菌抗性原理Cmlr

编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。a）抑菌原理a）杀菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。b）细菌抗性原理Kanr

编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。iv）链霉素（Streptomycin，Str）a）杀菌原理通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。b）细菌抗性原理Strr

编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。v）四环素（Tetracycline，Tet）b）细菌抗性原理a）抑菌原理通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tetr编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。②

遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（2）抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素4.人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体

但有特殊用途:由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。pLG338、pLG339、pHSG415等不适合大量扩增DNA用。适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。（3）失控的质粒载体（runawayplasmidvectors）这是一类温度敏感型复制控制质粒。温度低（低于37oC），拷贝数很少；温度增加（>40oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。1979年B.E.Uhlin等构建。如pBEU1、pBEU2。在这种高温环境下，细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了抑制，并失去了存活的能力，但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总DNA的50%。（4）插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性外源DNA无抗菌素抗性选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。（5）正选择的质粒载体(Directselectionvectors)如pUR2、pTR262等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。（6）表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expressionvectors）。它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。1）普通载体元件①表达载体的结构五、重要的大肠杆菌质粒载体

1.pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb。（3）选择标记四环素抗性Tetr6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）（4）克隆位点2.ColE1（1）类型天然质粒，属高拷贝型。（2）长度6.3kb。（3）选择标记大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！①colicinE1基因的结构ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因②杀死不含有ColE1细菌的原因cea+kil基因产物③不被其他细菌的colicinE1所杀死的原因imm基因EcoRI位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位点ColicinE1外源DNA无Colicin用对外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作选择，操作非常繁杂。对colicinE1敏感的细菌群体中自发突变产生抗colicinE1的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷ColE1抗colicinE1杀ColE1-仍抗colicinE1不杀ColE1-插入片断ColE1目前在基因克隆中广泛使用的一种大肠杆菌质粒载体。（1）pBR322质粒载体的构建缩小基因组的体积移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，限制酶识别位点，使质粒同存在任何易位子统统失去功能。易位子的转移（即易位）有可能导致选择记号的丧失，甚至也有可能使克隆的DNA片段丧失或重排。构建pBR322质粒的还必须通过体内易位或体外重组加入可选择的抗药性记号。3.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。Ampr来源Tn3易位8.3kb13.3kb2.6kbEcoRI*活性消化tetr来源5.3kbTn3易位10.2kbTn3易位8.8kbEcoRI*活性消化4.3kb构建关键：体内易位或体外重组加入可选择的抗药性标记；除去非必要的区段降低分子量。带控制大肠杆菌素E1合成的基因和Ampr基因带五个抗药性基因和带Ampr基因的易位子Tn3pMB8:带控制大肠杆菌素E1免疫性基因和EcoRI单一识别位点pMB9:带ColE1质粒复制特性，含对大肠杆菌素E1免疫性基因，EcoRI单一识别位点和四环素抗性基因pBR312：具双重抗性pBR313：Tn3易位子上的BamHI位点消失，不再易位pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：来源于R7268质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）.pSP2124质粒的Ampr基因pBR322元件来源①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记

插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。③高拷贝数②分子小，克隆能力大载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。Mob基因已经缺失，但保留了转移蛋白（mob）的作用位点。（6）pBR322的缺点能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！从生物安全的角度出发，不希望载体具易位能力及接合转移的功能①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeI