高三生物《多聚酶链式反应扩增DNA片段》讲义

一、基础知识（一）DNA分子的结构一、基础知识1、组成元素（一）DNA分子的结构一、基础知识C、H、O、N、P1、组成元素（一）DNA分子的结构一、基础知识C、H、O、N、P1、组成元素2、基本单位（一）DNA分子的结构一、基础知识C、H、O、N、P1、组成元素脱氧核苷酸2、基本单位（一）DNA分子的结构一、基础知识C、H、O、N、P1、组成元素脱氧核苷酸2、基本单位3、脱氧核苷酸结构（一）DNA分子的结构脱氧核苷酸结构式OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5’3’3’5’碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’多脱氧核苷酸链结构简图连接连接ATGC连接ATGCATGC连接ATGCATGC连接ATGCATGC3'端（含羟基）连接ATGCATGC5'端含磷酸基团3'端（含羟基）连接ATGCATGC5'端含磷酸基团3'端（含羟基）3'端连接ATGCATGC5'端含磷酸基团3'端（含羟基）3'端5'端5、DNA分子的双螺旋结构5、DNA分子的双螺旋结构①DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构5、DNA分子的双螺旋结构①DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构②脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对。5、DNA分子的双螺旋结构（三）DNA的复制2、时期3、场所1、概念（三）DNA的复制2、时期3、场所1、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程（三）DNA的复制2、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3、场所1、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程（三）DNA的复制2、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3、场所细胞核（主）、线粒体、叶绿体1、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程5、原材料6、基本条件4、模板5、原材料6、基本条件4、模板DNA母链5、原材料脱氧核苷酸6、基本条件4、模板DNA母链5、原材料脱氧核苷酸6、基本条件酶、ATP、原料、模板4、模板DNA母链7、复制过程7、复制过程①DNA的解旋7、复制过程①DNA的解旋亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链DNA聚合酶的特性

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。②RNA引物的合成②RNA引物的合成以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物②RNA引物的合成以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成②RNA引物的合成以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成冈崎片断④切掉引物生成冈崎片断在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断④切掉引物生成冈崎片断在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断⑤DNA片断的连接④切掉引物生成冈崎片断在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断⑤DNA片断的连接在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNADNA合成的方向从子链由5’端向3’端延伸思考：DAN复制的前提是什么？体外扩增DNA如何打开双链？DNA复制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN复制的前提是什么？体外扩增DNA如何打开双链？DNA复制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN复制的前提是什么？体外扩增DNA如何打开双链？双链的解开DNA复制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN复制的前提是什么？体外扩增DNA如何打开双链？双链的解开控制温度4.DNA分子的热变性原理：DNA双链4.DNA分子的热变性原理：DNA双链变性（加热80-100℃）4.DNA分子的热变性原理：DNA双链单链变性（加热80-100℃）4.DNA分子的热变性原理：DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）4.DNA分子的热变性原理：DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：4.DNA分子的热变性原理：DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：解开双链4.DNA分子的热变性原理：DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：复性的目的：解开双链4.DNA分子的热变性原理：DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合4.DNA分子的热变性原理：思考：高温使DNA解旋，但普通DNA聚合酶会失活，__________________找到耐高温DNA聚合酶。思考：高温使DNA解旋，但普通DNA聚合酶会失活，__________________找到耐高温DNA聚合酶。托马斯.布鲁克5、体外DNA复制的条件(PCR反应的条件)5、体外DNA复制的条件(PCR反应的条件)①DNA模板；5、体外DNA复制的条件(PCR反应的条件)①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物；5、体外DNA复制的条件(PCR反应的条件)①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物；③四种脱氧核苷酸；5、体外DNA复制的条件(PCR反应的条件)①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物；③四种脱氧核苷酸；④耐高温的聚合酶；5、体外DNA复制的条件(PCR反应的条件)①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物；③四种脱氧核苷酸；④耐高温的聚合酶；⑤控制温度，但不需解旋酶。（五）

PCR的反应过程1、PCR的反应步骤（五）

PCR的反应过程1、PCR的反应步骤

PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。2、循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火③延伸

DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸靶序列

靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列3、30次循环后靶序列扩增的数量3、30次循环后靶序列扩增的数量循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循环后靶序列扩增的数量4、PCR循环的结果4、PCR循环的结果①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸4、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸95℃变性（1）PCR循环——变性（1）PCR循环——变性95℃变性95℃变性（1）PCR循环——变性55℃复性（2）PCR循环—复性（3）PCR循环—延伸（3）PCR循环—延伸（3）PCR循环—延伸（3）PCR循环—延伸4、循环特点：①上一次循环的产物为下一循环的模板②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存于两个子代DNA分子中③其它子代DNA分子都为双引物分子式④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N二、实验步骤①准备好PCR反应体系的配方二、实验步骤①准备好PCR反应体系的配方②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分二、实验步骤①准备好PCR反应体系的配方②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁二、实验步骤①准备好PCR反应体系的配方②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁④离心10分钟二、实验步骤①准备好PCR反应体系的配方②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁④离心10分钟⑤将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序二、实验步骤①准备好PCR反应体系的配方②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁④离心10分钟⑤将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序⑥电泳检测PCR结果二、实验步骤

1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。三、操作提示

3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。目的：避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。四、结果分析与评价四、结果分析与评价(了解)2、具体方法如下。1）将样品进行50倍稀释：取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水。2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光

光度计(图5-12)的读数

调节至零。3）加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。4）根据下面的公式计算DNA含量。

DNA含量(μg/ml)=50×(260nm的读数)×稀释倍数五、课题延伸1、PCR优点：五、课题延伸原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作。1、PCR优点：五、课题延伸原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作。1、PCR优点：2、PCR技术的意义五、课题延伸复习：PCR技术与体内DNA复制的区别复习：PCR技术与体内DNA复制的区别1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；复习：PCR技术与体内DNA复制的区别1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；复习：PCR技术与体内DNA复制的区别1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。1.DNA单链的________末端为3'端，________末端为5'端，在DNA复制时，引物从模板链的______端配对结合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子链向下延伸。2.每次循环可以分为_________________这三个过程，对应温度分别为_______________________。练习1.DNA单链的________末端为3'端，________末端为5'端，在DNA复制时，引物从模板链的______端配对结合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子链向下延伸。2.每次循环可以分为_________________这三个过程，对应温度分别为_______________________。羟基练习1.DNA单链的________末端为3'端，________末端为5'端，在DNA复制时，引物从模板链的______端配对结合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子链向下延伸。2.每次循环可以分为_________________这三个过程，对应温度分别为_______________________。磷酸基团羟基练习1.DNA单链的________末端为3'端，________末端为5'端，在DNA复制时，引物从模板链的______端配对结合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子链向下延伸。2.每次循环可以分为_________________这三个过程，对应温度分别为_______________________。磷酸基团羟基羟基练习1.DNA单链的________末端为3'端，________末端为5'端，在DNA复制时，引物从模板链的______端配对结合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子链向下延伸。2.每次循环可以分为_________________这三个过程，对应温度分别为_______________________。磷酸基团羟基羟基DNA聚合练习1.DNA单链的