2015年剩余物课题研究报告

项目编号：GB05B601-03

黑龙江省重点科技攻关项目

森林采伐与木材加工剩余物综合利用技术研究

森林采伐剩余物资源化利用技术及设备的研究

课题负责人：王振宇

东北林业大学

二。。七年十一月

目录

目录

1绪论..........................................................1

1.1课题背景.............................................................1

1.2木质纤维素原料的预处理...............................................1

1.2.1物理方法.............................................................2

1.2.2化学方法.............................................................2

1.2.3生物法...............................................................2

1.3木质纤维素原料•转化燃料酒精的菌种选育.................................3

1.3.1高产纤维素酶复合菌的构建.............................................3

1.3.2发酵木糖生产酒精的菌种选育...........................................3

1.4木质纤维素原料转化酒精的固态发酵.....................................4

1.5木质纤维素原料转化酒精的发展现状及趋势................................5

1.6本课题的研究目标.....................................................6

1.6.1研究内容.............................................................6

2木质纤维素原料预处理工艺研究..................................8

2.1试验材料.............................................................8

2.1.1主要材料与试剂.......................................................8

2.1.2主要仪器及设备.......................................................8

2.2试验方法.............................................................9

2.2.1木质纤维素原料组分的测定.............................................9

2.2.2纤维素酶液的配制.....................................................9

2.2.3酸预处理.............................................................9

2.2.4碱预处理............................................................10

2.2.5微体化预处理........................................................10

2.2.6超低温微体化预处理..................................................10

2.3试验结果与讨论.......................................................10

2.3.1木质纤维素成份分析..................................................10

2.3.2酸预处理对木纤维素酶降解率的影响....................................11

2.3.3碱预处理对木纤维素酶解率的影响......................................11

2.3.4微体化与超低温微体化预处理对木纤维素酶降解的影响....................12

2.3.5几种预处理方式的比较................................................13

2.4结论................................................................14

3纤维素酶高产菌株的选育.......................................16

3.1试验材料..............................................................16

目录

3.1.1供试菌种............................................................16

3.1.2培养基及配制........................................................16

3.1.3主要试剂............................................................17

3.1.4主要仪器及设备......................................................17

3.2试验方法............................................................18

3.2.1还原糖的测定一3,5-二硝基水杨酸比色法...............................18

3.2.2纤维素酶活力的测定..................................................18

3.2.3抱子数的测定........................................................19

3.2.4粗酶液提取..........................................................19

3.2.5透明圈法鉴定纤维素酶产生菌..........................................19

3.2.6固体发酵法鉴定纤维素酶产生菌........................................20

3.2.7菌种间拮抗作用测试.................................................20

3.2.8二元混菌体系构建....................................................20

3.2.9菌种配比对产酶的影响................................................20

3.3结果与讨论...........................................................20

3.3.1葡萄糖标准曲线的绘制及回归方程的确定................................20

3.3.2纤维素酶活力的测定..................................................21

3.3.3透明圈法鉴定纤维素酶产生菌..........................................21

3.3.4固体发酵法鉴定纤维素酶产生菌........................................21

3.3.5菌种间拮抗关系测试..................................................22

3.3.6纤维素酶高产菌株的组建..............................................23

3.3.7菌种配比对产酶的影响................................................23

3.4结论................................................................24

4固态发酵生物反应最佳过程控制参数确定.........................25

4.1试验材料............................................................25

4.1.1菌种................................................................25

4.1.2培养基..............................................................25

4.1.3主要试剂............................................................25

4.1.4主要仪器及设备......................................................25

4.2试验方法............................................................26

4.2.1传代培养............................................................26

4.2.2种子扩大培养........................................................26

4.2.3液体发酵剂的制备....................................................26

4.2.4接种...............................................................26

4.3结果与讨论...........................................................26

4.3.1温度、湿度、pH值及搅拌时间间隔的确定...............................26

-II-

目录

4.3.2底物初始含水量，接种量，颗粒度的确定................................29

4.4结论..................................................................31

5固态发酵模式对糖转化率的影响.................................32

5.1发酵培养基灭菌模式研究...............................................32

5.1.1高温高压灭菌........................................................32

5.1.2超声波灭菌..........................................................32

5.1.3臭氧灭菌............................................................32

5.1.4微波灭菌............................................................32

5.1.5儿种灭菌方式的比较..................................................32

5.2搅拌模式确定.........................................................33

5.2.1搅拌模式对基质混合效果的影响........................................33

5.2.2搅拌模式对传热的影响................................................34

5.2.3搅拌模式对固态发酵糖转化率的影响...................................36

5.3反应釜模式对固态发酵的影响...........................................37

5.3.1反应釜几何形状对固态发酵的影响......................................37

5.3.2反应釜容积确定......................................................40

5.3.3通气模式对固态发酵糖转化率的影响...................................40

5.3.4通气面积与通气孔孔径设置对固态发酵糖转化率的影响....................41

5.4结论................................................................44

6最佳反应模式下纤维素固态发酵动力学模型的建立.................45

6.1最佳固态发酵模式动力学模型的建立....................................45

6.1.1最佳固态发酵模式不同反应时间的反应物及产物含量测定..................45

6.1.2建立最佳反应模式动力学模型..........................................46

6.2浅盘固态发酵模式动力学模型的建立....................................47

6.2.1浅盘固态发酵模式不同反应时间的反应物及产物含量测定..................47

6.2.2浅盘固态发酵反应模式动力学模型的建立................................48

6.3最佳反应模式与浅盘模式动力学模型的比较...............................49

6.4结论.................................................................50

7高产乙醇酵母菌株的诱变选育...................................51

7.1试验材料.............................................................51

7.1.1供试菌种............................................................51

7.1.2培养基及配制........................................................51

7.2试验方法............................................................52

7.2.1产乙醇能力强的出发菌株的筛选........................................52

7.2.2紫外诱变............................................................52

7.2.3酵母菌一级筛选一TTC法..............................................53

in-

目录

7.2.4酵母菌二级筛选一杜氏小管法..........................................53

7.2.5酵母菌的三级筛选一C02失重法.......................................53

7.2.6糖浓度对乙醇产率的影响..............................................53

7.2.7诱变菌株的遗传稳定性试验............................................54

7.2.8分析测定方法........................................................54

7.3结果与讨论...........................................................55

7.3.1产乙醇能力强的出发菌株的筛选........................................55

7.3.2诱变剂量的选择......................................................56

7.3.3酵母菌一级筛选一TTC法..............................................57

7.3.4酵母菌二级筛选一杜氏小管法..........................................57

7.3.5酵母菌三级筛选一（3。2失重法..........................................59

7.3.6糖浓度对乙醇产率的影响..............................................59

7.3.7诱变菌株UV2的遗传稳定性试验.......................................59

7.4结论................................................................60

8同步糖化发酵纤维素转化乙醇最佳工艺参数确定...................61

8.1试验材料............................................................61

8.1.1供试菌种............................................................61

8.1.2培养基及配制........................................................61

8.2试验方法............................................................62

8.2.1发酵温度对SSF产乙醇的影响.........................................62

8.2.2纤维素酶用量对SSF产乙醇的影响.....................................62

8.2.3菌株接种量对SSF产乙醇的影响.......................................62

8.2.4发酵时间对SSF产乙醇的影响.........................................62

8.2.5SSF发酵试验.......................................................62

8.3结果与讨论...........................................................62

8.3.1发酵温度对SSF产乙醇的影响.........................................62

8.3.2纤维素酶用量对SSF产乙醇的影响.....................................63

8.3.3菌株接种量对SSF产乙醇的影响.......................................64

8.3.4发酵时间对SSF产乙醇的影响.........................................64

8.3.5SSF发酵试验.......................................................65

8.4结论................................................................66

9泡沫分离法提取发酵液单细胞蛋白及超吸收聚合物研究.............67

9.1实验材料与设备.......................................................67

9.1.1试验材料与试剂......................................................68

9.1.2试验设备............................................................68

9.2试验方法.............................................................68

-IV-

目录

9.2.1单细胞蛋白的测定方法................................................68

9.2.2泡沫分离法提取发酵液单细胞蛋白......................................68

9.2.3超吸收聚合物的持水性测定............................................69

9.3实验结果与讨论......................................................70

9.3.1蛋白标准曲线的绘制及回归方程的确定..................................70

9.3.2泡沫分离法提取发酵液单细胞蛋白结果分析..............................70

9.3.3超吸收聚合物的持水性测定结果分析....................................72

9.4结论................................................................73

结论...........................................................74

-V-

EnglishCatalog

1绪论

1.1课题背景

全世界每年大约形成1000-2000亿t植物有机质，其中有85%是纤维素物质，我

国每年仅农业生产中生产形成的农作物残渣就约有10〜13亿t,黑龙江森工林区采伐后

丢弃的枝丫有2000万3同时工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物，其中除很小的

一部分被直接还原自然和用为动物饲料外，绝大部分都被焚烧掉，这样不但污染环境，

又造成资源的巨大浪费。这类纤维物质主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分构

成。目前上述纤维废弃物，除少部分用于糠醛、木糖、食用菌等产品的生产外，大部分

未得到合理的利用。因此，从可持续发展战略的角度考虑，合理开发利用植物纤维素资

源已是刻不容缓、势在必行。通过本项研究，发展替代资源，通过植物纤维素的开发利

用，在能源、生产资料、生产工艺等方面摆脱传统的产业模式，促进现代工业、农业和

生态工程的发展。获得新的食品、药品、保健品、生物制品、农副产品、环保材料和工

业制品的原料资源。用植物纤维素可以制成保水剂、土壤改良剂和超吸收聚合物等等，

可以用于荒漠化、沙化和盐碱化治理，从根本上改变土壤的理化性质，使脆弱的生态环

境得到重建。随着经济的飞速发展，地球上的石油、煤炭储量正以惊人的速度减小，这

种局面如不改变，人类将面临一场严峻的能源危机。

本项目采用超微粉碎结合微生物降解对采伐剩余物进行预处理，使植物纤维素及木

质素充分解链，同时用筛选出的组合菌对降解产物进行固态发酵，并用蒸储配合汽膜分

离技术分离纯化乙醇，同时用超速离心配合泡沫分离技术分离纯化单细胞蛋白及超吸收

聚合物。研制出使森林采伐剩余物资源化的固态发酵生物反应器，采用全新的蜂窝脉动

式固态发酵技术，使植物纤维素及木质素的转化率大为提高，为充分开发利用森林采伐

剩余物开辟了一个新的途径。该项技术的突破将在发展替代资源、合成环境友好材料以

及缓解能源危机等方面起到十分重要的作用。L可以提高纤维素的利用途径，通过植物

纤维素的开发利用，在能源、生产资料、生产工艺等方面摆脱传统的产业模式，促进现

代工业、农业和生态工程的发展。获得新的食品、药品、保健品、生物制品、农副产

品、环保材料和工业制品的原料资源。2.用植物纤维素可以制成保水剂、土壤改良剂和

超吸收聚合物等等，可以用于荒漠化、沙化和盐碱化治理，从根本上改变土壤的理化性

质，使脆弱的生态环境得到从建。3.利用植物纤维素这种可再生资源生产乙醇和烯煌类

化合物，进一步替代石油、煤炭等一次性资源，对于缓解未采面临的能源危机，确保经

济的可持续发展具有重要意义。

1.2木质纤维素原料的预处理

预处理的目的是改变天然纤维素的结构，破坏纤维素一木质素一半纤维素之间的连

-1-

绪论

接，降低纤维素的结晶度，脱去木质素，增加原料的疏松性以增加纤维素酶系与纤维素

的有效接触，从而提高酶效率。人们探讨了多种预处理方法，大致可分为物理法、化学

法、生物法。

1.2.1物理方法

微粉碎处理是用球磨或碾磨将纤维素类物质粉碎，促进糖化；同时，经过粉碎的纤

维素粉末没有膨润性，体积小，可以提高基质浓度，得到高浓度的糖化液。

微波是指300MHz〜300KMHz范围的电磁波，微波处理时间短、操作简单、糖化效

果好，但由于处理费用高而难以得到工业化应用。

蒸汽爆碎预处理是近年来发展起来的一种新的预处理方法，用高温高压下的饱和水

蒸气使木质素的a-丙烯乙醛及部分的丙烯乙酸裂开，破坏木质素、半纤维素结合层，

然后突然将压力降至常压，这样纤维素的空隙增大。蒸汽爆碎预处理工艺的费用较低，

效果明显；但此处理过程中木质素未被除去，虽然较高的基质浓度也只能得到低浓度的

糖液。

高能辐射（丫射线、电子辐射等）可使纤维素物质的聚合度（DP）降低，结晶性减少，

吸湿性增加，这些都有力于纤维素的酶水解。Saeman等1952年报道，辐射剂量大于

106rad就能提高纤维物料的水解速度和转化率。当辐射剂量达108rad时，水解处于最佳

状态，此时糖的得率是对照的3倍，而水解速度则提高了17倍。但是辐射处理的成本

达每吨138〜156美元，比研磨成本还高，目前还很难用于大规模生产。

Bykov和Frolovl961年指出，纤维素在水悬浮液中反复冷冻和融化（降至-75℃）可以

降低DP水平和增加反应活性。Noriinshol980年的专利概述了冻结法在减少颗粒大小和

改变其结晶方面的作用。

1.2.2化学方法

稀酸水解已经成功地用于木质纤维素原料预处理，稀硫酸预处理可以获得较高的得

率，显著促进纤维素水解。但酸处理污染环境，对设备条件要求高。

碱处理有较强的脱木质素作用，原料除去木质素后，酶水解糖化率将明显提高。

臭氧法可以用来分解木质纤维素原料中的木质素和半纤维素。该方法中木质素受到

很大程度的降解，但由于需要的臭氧量比较大，整个过程成本较高。

1.2.3生物法

虽然有许多种微生物能产生木质素分解酶，但活性低，一时难以得到利用。木腐菌

是分解木质素能力较强的菌，通常分为三种：白腐菌、褐腐菌、软腐菌，而以白腐菌分

解木质素的能力较强。瑞典等北欧国家则利用无纤维素酶的担子菌突变株对纤维素材料

进行脱木素处理，取得了显著的效果。微生物处理方法具有节约化工原料•、能源和减轻

环境污染等方面的优点，但微生物处理方法的一个最大缺点是处理周期长，而且许多白

腐真菌在分解木质素的同时也消耗部分纤维素。采用基因工程技术对白腐菌进行遗传改

良，将有助于拓展生物法预处理的实际应用。

-2-

绪论

1.3木质纤维素原料转化燃料酒精的菌种选育

1.3.1高产纤维素酶复合菌的构建

复合微生物群是由两种或两种以上的微生物共同培养、相互作用、相互影响，最终

达到发挥其最大群体优势的微生态系统。采用混菌培养有可能获得新型的或优质的发酵

产品，混菌培养有时比单菌培养反应更快，产率更高，微生物性能更稳定，所获得的产

品往往具有特殊的风味，且在防治杂菌污染方面很占优势。在这样的混合体系中，正常

的微生物菌群往往是优势菌群，杂菌基本上没有生存空间，但是混菌培养的反应机制较

复杂，许多产品中微生物混合发酵的机理有待阐明。崔宗均，朴哲等以高温堆肥为原

料，从中分离、构建了一个具有高效分解天然纤维素能力的复合系MCI,MCI最适的

产酶温度为50〜60℃,在pH5〜9的范围内均可产生较高的酶活，在中性酸碱度、55℃条

件下，3天可以把培养基重量0.5%的滤纸完全分解，MCI高效的纤维素分解能力在2

年以上连续传代的情况下仍保持很好，高效纤维素分解复合系MCI把天然纤维素分解

的过程在试验室条件人工再现。所以，具有纤维素分解能力的复合系的研究是今后纤维

素微生物分解研究的方向，具有光明的前途。

在诸多报道中，丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群，其在降解纤维素底物时，

菌丝穿过次生壁进入胞腔，由内向外降解纤维素，使纤维逐步被破坏。而细菌则是粘附

在纤维上，从纤维的表面向内生长，在接触点处纤维素被降解，使纤维表面呈锯齿蚀

痕。木霉属(THMode”")是目前研究最多的纤维素降解菌，其中最重要的是里氏木霉(工

reesei),但里氏木霉菌株的不足之处是尽管它们能产生高活力的3酶和Cx酶，但形成

纤维二糖酶的能力较低。而许多曲霉属菌种，如黑曲霉(4*e喏sniger),海藻曲霉(4

Phoenicis)等,能产生高活力的纤维二糖酶。另据报道，由日本筛选出的棘抱曲霉(4

“c〃/eH〃s)No.F-50,能产生较好的纤维素酶系，其粗酶液对纸浆有很强的协同降解能

力，而且纤维二糖酶活力和半纤维素酶活力均较高。为了使维素酶系对纤维素材料的协

同作用效率提高，可通过不同菌种的混合发酵，达到较大的纤维素酶解率。

1.3.2发酵木糖生产酒精的菌种选育

在木质纤维素纤维的糖化液中30%为戊糖(以木糖为主)，70%为己糖(以葡萄糖为

主)，这些糖类是燃料乙醇产生的直接物质。但20世纪80年代以前人们认为木糖(戊糖)

不能被酵母发酵，造成糖化液中30%的戊糖成分不能被利用，直接导致燃料乙醇的产率

低。直到1980年Wang等提出木糖可以被一些微生物发酵生成乙醇后，国际上掀起了

一股木糖乙醇发酵菌株的研究热潮，迄今已发现100多种微生物可代谢木糖生成乙醇，

包括细菌、丝状真菌和酵母。其中酵母菌发酵木糖能力最强，目前人们研究最多的最具

有工业应用前景的发酵木糖产乙醇的微生物有三种酵母菌即嗜糅管囊酵母(PacWso/e〃

tarmophilus)、树干毕赤酵母和休哈塔假丝酵母(CZ〃龙dashehatae)»但是这

些菌株的乙醇耐受能力差，发酵过程中控氧条件严格，同时也只能在常温条件下进行发

酵，这就影响其工业应用。

-3-

绪论

提高酿酒酵母发酵生产乙醇效率的方法有二：一是探索新的发酵工艺；二是选育高

产的乙醇酵母。如果能够运用一定的方法，使酵母菌能在高温条件下正常的生长发酵，

且耐受乙醇的能力强，并具有高效的转化戊糖和己糖生成乙醇等优良性能，这样的菌株

无疑对乙醇发酵工业有着非常重要的社会与经济意义。

诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，显著提高变

异的频率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变菌株，作生产和研究之用

〔3刃。新的微生物菌种决定着微生物代谢产品，但菌种的生产能力高低，则决定着微生物

产品的开发和生产前景，因此，微生物的诱变育种是及其重要的环节。

1.4木质纤维素原料转化酒精的固态发酵

固态发酵（SolidStateFermentation,SSF）一词，广义上讲，是指一切使用不溶性固

体基质来培养微生物的工艺过程，包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有

（或几乎没有）游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。在多数情况下是指没有或

儿乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发

酵的一个生物反应过程川。本课题中所提到的固态发酵均是指后者。

现代发酵工业是当代生物技术产业中以工业化方式生产的主体部分，其发酵技术水

平是一个国家生物技术产业发展水平的重要标志之一。众所周知，微生物发酵方法有两

类:液体深层发酵与固态发酵。1945年青霉素的大规模工业化生产开创了液体深层发酵

技术及现代发酵工业⑷，发酵工程与生化工程也由此应运而生。固态发酵有着悠久的历

史，早在儿千年前，我国就已经利用这项技术酿酒和制造各种调味品。只因固态发酵技

术至今未达到纯种培养与大规模产业化要求，使固态发酵的生产应用处于停滞状态，一

直被隔离在现代发酵工业的大门之外，作为传统与落后的代表而被忽视。当液态发酵与

固态发酵具有相同的经济性能时，液态发酵的许多特征使其成为较优选的方法。重要的

是，液态发酵的传热、传质均匀性使其有较大程度的可行性。固态发酵含有不溶于水的

固体、少量的水分及空气，微生物生成的热导致水分蒸发，使发酵体系具有气液固不均

匀三相，存在严重的浓度梯度及传热、传质困难，这样很难控制pH、水活度、最佳反应

温度等，使产量大大下降。然而近儿年，由于能源危机与环境问题的日益严重，出现了

一些重大的问题，如：土壤污染及其生物治理的可能性，疯牛病的流行及寻找牲畜饲料

替代品的必要性等，随着这些问题的提出，固态发酵技术以其特有的优点（如无“三废”排

放）引起人们极大的兴趣。与其他培养方式相比，固态发酵具有如下优点：（1）培养基简单

且来源广泛，多为便宜的天然基质或工业生产的下脚料；（2）投资少，能耗低，技术较简

单；（3）产物的产率较高；（4）基质含水量低，可大大减少生物反应器的体积，不需要废

水处理，环境污染较少，后处理加工方便；（5）发酵过程一般不需要严格的无菌操作；（6）

通气一般可由气体扩散或间歇通风完成，不需要连续通风，空气一般也不需严格的无菌

空气。同时，随着微生物基因遗传技术的应用、优良菌株的发现和筛选，以及生产工艺

等方面的改进，固态发酵技术也得到了进一步发展。通过研究不同因素对于真菌代谢物

-4-

绪论

的影响而显现出了固态发酵的在应用和生产方面的潜力。由此可见，固态发酵将为解决

能源、环境等问题开辟一条新的途径。对固态发酵的研究也将迈上一个新的台阶。

迄今为止已有许多类型的固态发酵反应器问世（包括试验室、中试、工业生产规

模）。B.Lonsane曾经归纳出了九种不同形式的工业规模的固态发酵反应器:（1）转鼓式；（2）

木盒式；（3）加盖盘式；（4）垂直培养盒式；（5）倾斜接种盒式；（6）浅盘式；（7）传送带式；

（8）圆柱式；（9）混合型式等。K.E.Aidou也提出了十种不同形式的固态发酵反应器；但以

基质的运动情况则可以分为两类：（1）静态固态发酵反应器，包括浅盘式和塔柱式反应

器；（2）动态固态发酵反应器。

目前静态固态发酵反应器在试验室研究中应用较为普遍，尤其是圆柱式的固态发酵

反应器，文献报道的系统，多是将一个或多个静态圆柱式反应器平行放在一个恒温箱中

并通以饱和空气。

动态固态发酵反应器包括机械搅拌的筒，柱式、转鼓式反应器等。动态固态发酵反

应器内微生物生长较快并且均一，放大过程中所遇到的困难是由于物料运动导致在生长

过程中菌丝被伤害，这个问题的严重性随着发酵器容积的增大而增加。此外，在放大过

程中还会存在:发酵体系湿度控制，保持不染菌，发酵基质聚集成球状而影响传质传热

等诸多方面的问题。

1.5木质纤维素原料转化酒精的发展现状及趋势

纤维素类资源具有来源丰富、品种多、再生时间短等优点。因此，以纤维素降解发酵

生产乙醇是一个具有巨大潜力的新领域。

美国政府曾规划在2001—2003年期间利用稻壳、甘蔗渣、生活有机垃圾、林业废物

等以纤维素为主的生物质为原料，建设6个年产5-7.6万kL的燃料乙醇工厂。目前，日本

是世界第3石油进口大国，也希望利用本国资源生产燃料乙醇，但由于其国内粮食生产不

足，故对以纤维素为主的生物质废物为原料生产燃料乙醇的技术十分重视。日本每年产有

1000万t废木屑，不少企业利用自行开发的技术或引进美国技术开展了以废木屑为原料

生产燃料乙醇的工业试验。特别是该国的酒精协会，在借鉴美国技术基础上提出了系统的

开发方案，希望快速发展燃料乙醇，减少对石油进口的依赖，同时减少CO2的排放。

我国是一个石油消费大国,但是石油资源却相对贫乏。自1993年开始，我国就成了石

油净进口国，国家每年都要花费大量的外汇用于换取石油,为了减少石油的进口，国家计委

于2001年4月，宣布向全国推广使用车用汽油酒精。目前我国的酒精主要以玉米、小

麦、薯干等粮食为原料经过发酵生产而成，而我国是一个人口大国,粮食过剩只是暂时的

现象，粮食作为原料生产酒精决非长远之计。车用汽油酒精的推广必将增加粮食的供需矛

盾。但我国有十分丰富的植物纤维资源，尤其是农林废弃物资源，开展利用农林废弃物生

产燃料酒精的研究不仅可以解决长期以来困扰我国农林废弃物的利用问题,而且可以缓解

我国的粮食和能源紧张。因此，利用植物纤维发酵生产酒精的研究,具有十分重要的现实

和长远的意义。

-5-

绪论

21世纪面临的能源危机困扰着世界各国。绝大多数能源界学者预计，到2050年前

后，世界将面临能源的枯竭，发酵酒精和甲醇将是最现实的液体燃料替代用品。如从减

少大气中温室气体浓度、防止地球气温升高的观点出发，那么发酵酒精将是除了比和

电能外，唯一能现实的汽油替代品。根据我国汽油现在的消耗水平进行理论预测,若在汽

油中添加10%体积的燃料乙醇，则可替代400万吨等量的汽油，一年可为国家节省外汇15

亿美元。纤维素类物质是世界上最大的可再生资源，各国都在研究其转化燃料乙醇的技

术，以解决能源安全和减少环境污染，因此，纤维素类物质生产燃料酒精具有广阔的发

展前景。

1.6本课题的研究目标

二十一世纪人类面临资源紧缺、环境污染、生态破坏等一系列严峻的挑战。其中资

源问题已经成为人类社会，特别是中国这样的发展中人口大国可持续发展的最主要瓶

颈。生物乙醇是近年来最受关注的石油替代燃料之一。目前虽然粮食淀粉的生物乙醇已

基本实现规模化生产。但从战略发展的视角看，世界各国都将各类植物纤维素(包括速

生林木、林业采伐及加工剩余物、农作物秸秆等)作为可供使用生产燃料乙醇丰富而廉

价的原料来源，其中利用木质纤维素转化燃料乙醇将是解决原料来源和降低成本的主要

途径之一。

随着全球经济社会的发展，特别是中国经济的快速发展，对林业生物质能源提出了

新的更高的需求。大力开发和利用林业生物质能源，对于保障能源安全、改善生态环

境、推动林业发展，都具有十分重要的意义。但目前纤维素酶的低活力和低产量以及选

育能高效同化五、六碳糖的乙醇酵母却是生物转化纤维素的两大障碍，因此影响了其工

业化生产和广泛应用。生物技术对于克服和解决这些问题具有无可替代的重要作用。开

发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类

急需的燃料、饲料及轻工、化工、医药产品，可以推动未来经济体系的基础，从逐渐枯

竭的石油资源向可再生的生物质资源转化，构建可持续发展的循环型社会，具有极其重

要的意义和光明的发展前景。本课题正是针对以上儿方面进行考虑，研究木质纤维素转

化燃料酒精的技术路线及工艺研究。

1.6.1研究内容

(1)考察了不同预处理方法对木质纤维素原料酶水解的影响，这儿种方法包括：酸处

理、碱处理、微体化预处理和超低温微体化预处理等方法。其中，超低温微体化预

处理木质纤维素原料的方法至今未见报道。

(2)通过透明圈法、固体发酵法及菌种拮抗关系，研究了优良稳定的五种真菌的特性，

并构建了高产纤维素酶二元混菌体系，确定最优菌种配比。

(3)确定木质纤维素原料固态发酵的过程控制参数和最佳控制方式。

(4)确定反应釜的外观形状，儿何尺寸、通气面积等参数，确定适合于纤维素类物质的

最佳固态发酵反应模式。

-6-

绪论

(5)依据以上内容，以米氏方程为基础，建立纤维素原料固态发酵的动力学模型。

(6)采用紫外线诱变，分离、筛选、驯化培养一株高效戊糖和己糖乙醇发酵菌株。采用

单因素和正交试验对同步糖化发酵条件进行优化。

(7)采用泡沫分离法对木质纤维素发酵后混合物中的单细胞蛋白进行分离提取，研究最

佳提取条件及工艺参数。

(8)对木质纤维素发酵后所获得的超吸收聚合物的持水性进行测定。

-7-

木质纤维素原料预处理工艺研究

2木质纤维素原料预处理工艺研究

纤维素分子是由大量的P-D葡萄糖分子以供1,4-糖首键连接组成的链状聚合物。在

天然植物纤维原料中，纤维素通常总是与半纤维素、木质素共存，形成复杂的结构。由

于目前所筛选的许多高酶活的纤维素分解菌，其半纤维素酶及木质素酶活性不高，很难

将天然植物纤维的三大组成成份降解。另一方面，由于天然的复杂结构，又直接影响着

纤维素酶的作用。进行植物纤维原料的预处理有利于纤维素酶降解和转化，并且预处理

的效果直接影响着纤维素酶水解的结果。目前预处理方法大致可分三种类型：化学法、

物理法和生物法。本章主要选择酸、碱、微体化、超低温微体化四种预处理手段，比较

其四种预处理方法的特点及其对木质纤维素酶水解的影响因素。

2.1试验材料

2.1.1主要材料与试剂

木质纤维素粉体来源于哈尔滨市某木材加工厂

葡萄糖分析纯天津市东丽区天大化学试剂厂

3,5-二硝基水杨酸分析纯上海化学试剂采购供应五联化工厂

浓硫酸分析纯北京新光化工试剂厂

丙酮分析纯天津市福晨化学试剂厂

甲苯分析纯天津市福晨化学试剂厂

氢氧化钠分析纯天津市福禄化工试剂厂

甲基橙分析纯天津市福晨化学试剂厂

无水乙醇分析纯北京化工厂

柠檬酸钠分析纯天津市东丽区天大化学试剂厂

柠檬酸分析纯天津市东丽区天大化学试剂厂

十六烷基三甲基滨化镀分析纯上海山浦化工有限公司

十二烷基硫酸钠分析纯天津市石英钟厂霸州市化工分厂

盐酸分析纯天津市东丽区天大化学试剂厂

2.1.2主要仪器及设备

微型植物粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司

722型可见分光光度计上海第三仪器有限公司

ALC110.4电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司

101-2A电热鼓风干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司

电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司

GXZ型智能光照培养箱宁波江南仪器厂

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木质纤维素原料预处理工艺研究

马富炉天津市中环试验电炉有限公司

球磨机ND6-2L型南大天尊设备有限公司生产

PHS-3C酸度计上海精密科学仪器有限公司

98-1-13电子控温电热套天津市泰斯特仪器有限公司

FW100高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司

超声波清洗器上海科导超声仪器有限公司

2.2试验方法

2.2.1木质纤维素原料组分的测定

2.2.1.1中性洗涤纤维NDF的测定

准确称取风干样品0.5〜1.0克放入100毫升中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠，PH=7）

内煮沸1~2小时，冷却结束后，用100目尼龙绢纱套在玻璃漏斗上进行抽滤，滤渣转入

已称重的玻璃滤锅，热水冲洗数次，真空抽滤，除去部分水份后，放入100℃烘箱烘干

后，再在干燥器中冷却，恒重，即可求出中性洗涤纤维NDF量。

2.2.1.2酸性洗涤纤维ADF的测定

称取风干样品2〜5克，（粉碎，通过1毫米筛孔），于回流容器中加入100毫升酸性

洗涤剂20克十六烷基三甲基烷化氨于1升L0N浓硫酸中）5〜10分钟内加热至沸腾，回

流1小时，用套有尼龙绢纱的玻璃漏斗抽滤，转入已称量玻璃滤锅（100-120目孔径），

每次用50毫升热水冲洗数次，真空抽滤，最后用丙酮洗涤1〜2次，于100℃烘箱内烘

干，冷却后恒重，即可求出酸性洗涤纤维ADF。

2.2.1.3酸不溶木质素的测定

将装有酸性洗涤纤维的珀期内加入72%硫酸液浸没内容物，搅拌成糊，在15c下

消化3小时，真空抽干，热水多次洗涤，pH试纸检查无酸性，置珀蜗于100C烘箱内烘

干，放在干燥器中冷却称至恒重。再将其灰化，留下的灰分为样品中硅酸含量，称酸不

溶灰分，烘干沉淀量与灰化量之差为酸不溶木质素ADL。

纤维索=ADF-ADL-灰分。

2.2.2纤维素酶液的配制

准确称取纤维素酶制剂0.5g于100mL小烧杯中，用少量蒸储水溶解后，移入

100mL容量瓶中，用蒸储水定容至100mL,酶液的浓度为5mg/mL,4℃冰箱中保存备

用。

2.2.3酸预处理

分别称取一定量木纤维素粉体，各加入0.5%,1%,2%,3%,4%,5%,6%的稀

硫酸，固液比1:10,室温放置24小时后过滤，将滤液调pH至中性（0.1%甲基橙为指示

剂），测定水抽提液的含糖量。将滤渣用水冲至中性，烘干以后取1.0g,加入50mL纤维

素酶溶液（酶液配制05g纤维素酶溶解于100mLpH4.8,0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓

-9-

木质纤维素原料预处理工艺研究

冲溶液)在50c静置保温48h后煮沸灭活，测定还原糖量。

2.2.4碱预处理

分别称取一定量木纤维素粉体，分别加入0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%>3.0%>

4.0%的NaOH,固液比为1:25,室温放置24小时后过滤，将滤液调pH至中性(0.1%甲

基橙为指示剂)，测定水抽提液含糖量。将滤渣用水冲至中性，烘干以后取LOg,加入

50mL纤维素酶溶液(酶液配制:0.5g纤维素酶溶解于100mLpH4.8,0.05mol/L的柠檬酸-

柠檬酸钠缓冲溶液)在50℃静置保温48h后煮沸灭活，测定还原糖量。

2.2.5微体化预处理

取10g烘干的木质纤维素粉体，装入球磨机磨罐中，加入玛瑙球后调节球磨机转数

为200转/分，在不同时间内进行微体化处理，然后用振动筛进行筛分至50〜250nm。取

木质纤维素微粉体1.0g,加入50mL纤维素酶溶液(酶液配制:0.5g纤维素酶溶解于

100mLpH4.8,0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)在50℃静置保温48h后煮沸灭

活，测定还原糖量。

2.2.6超低温微体化预处理

取10g烘干的木质纤维素粉体，在温度为-196℃条件下进行超低温快速冷冻，待物

料充份冷冻后，迅速取出放入球磨机磨罐中，加入玛瑙球后调节球磨机转数为200转/

分进行研磨lh,在不同的时间内进行如此冻磨处理。从预处理后的物料中取1.0g,加入

50mL纤维素酶溶液(酶液配制：0.5g纤维素酶溶解于100mLpH4.8,0.05mol/L的柠檬酸

■•柠檬酸钠缓冲溶液)在50℃静置保温48h后煮沸灭活，测定还原糖量。

预处理的转化率(％)=垩"、100%(2-1)

MxC

式中S——预处理本身产生的还原糖量(g)

M——预处理物干重(g)

C——木质纤维质原料含量

Qx0o

酶解糖化率(％)=——-xlOO%(2-2)

MxC

式中S——酶解液中还原糖量(g)

M——预处理物千重(g)

C——木质纤维质原料含量

2.3试验结果与讨论

2.3.1木质纤维素成份分析

表2-1木质纤维素成份表

水分％半纤维素％纤维素％木质素％灰分％可溶物％

4.1625.144.716.65.653.83

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木质纤维素原料预处理工艺研究

2.3.2酸预处理对木纤维素酶降解率的影响

14

12

10

糖转化率（%）8

6

4

2

0