葡萄籽花青素治疗脊髓损伤的实验研究

究义义伤脊髓损伤的治疗有。究状髓伤(SpinalCordinjury，SCI)所造成的外伤性截瘫是最严重的外伤之一。据统计，全世界内SCI的发病率大约240例/100万人/年[1交增,外并SCI的病例有增的。因此SCI的及了更广泛的关注。SCI可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是由机械压迫、出血所致的神经细胞、轴突和血管的直接损伤，在短时间内形成且多为不可逆的。长期以来，国内外学者对脊髓继发性损伤的可能机制做了大量的探索，发现继发性脊髓损伤是多种神经生化机制及微血管机制相互级联、不断恶化的过程，如兴奋性氨、C2、炎症反应、能量代谢紊乱、乳酸堆积等，这直接导致细胞坏死和紧接着的细胞凋亡的发生。继发性损伤发生在相对较长时间内，且这种损伤是可逆的。继发性损伤加重和超过了原发性损伤的程度。到目前为止，对原发性脊髓损伤的治疗主要依靠外科手术，对继发性损伤的治疗包括药物治疗、高压氧治疗、电刺激治疗、基因治疗。临床常见的脊髓损伤多为产生于即刻的机械损伤和随之发生的继发性损伤，而脊柱损伤后的血管和神经生化机制是脊髓损伤的主要机制。如何防止继发性病理改早。原花青素是中草药及植称，由不同数量的茶，属于生物类黄酮。1961年从山楂新鲜果实的提取物中首次分离得到原花青素，后又相继在葡萄、山楂、花生、银杏等植物及中药金荞麦、地榆根、大黄中发现原花青素，其中以葡萄和树中最高中量发药行了许多体内、体外和离体细胞实验研究[2,3]，但国内这方面的研究起步较晚，最近的几年国内的学（gaesedproanthocyanidin,GSP目前为止抗氧化能力最强的天然提取物，其在体内的抗氧化、清除自由基的能力是维生素E的50，素C的0倍[4]。发现P可以缺伤[样硬化[7]伤[8]注损伤与P氧由力有关。志[10现P可制B的降、NFB的调iS的大鼠脑缺血再灌注后的炎症反应。并且iWen-guan[11]等人研究发现，GSP的大鼠足肿和巴豆油诱发的小鼠耳肿的炎症渗出液中一氧化氮合酶和氨基葡萄糖苷酶活性，降低IB、瘤死和腺素E2含另究道[P显著减低大鼠脑组织中I1的表达，提示P提高脑组织的抗炎性从而对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。Blazs等[13]认为,E能够抑制致炎细素8子α明GSP径发挥着的涌[1在究PC12现P可明显轻H2O2的氧化损伤，表现为PC12比,Capae3低悦]等发现GSP深温R程中可制Cass3A达,进凋亡脑作有道[P对H2O2GP加B2表达同少Bax表达有关由此可以看出GSP可以制Caspase-3介导的细胞凋亡同时调控Bc2和Bx基因外GSP还可促外C2+的稳由Ca2。测GSP来直接以,制NFB的激活,制iNOS的表达来减轻炎症反应对细胞的伤害。以及通过对一氧化氮合酶水平的调节进而有效清除自由基和保循和亡P控Ca3、2和Bax的达SP能较恢复。存在的问题：目前葡萄籽花青素对脊髓损伤的研究还不太成熟，这方面的文献太少，这就为们在物面的。题：的D大鼠做不同浓度梯度的葡萄籽确验籽的。设案1.设计目标及拟解决的关键问题：通过治疗组、假手术组与对照组治疗效果的对比，得到葡萄籽花青素对脊髓损伤的治疗的确有一定的治疗作用。实验模型的制备。对试验性脊髓损伤的模型进行分指法结。2.实验设计2.1实验：用200gD大：(1）D大鼠易得到，容。(2）00gSD太难量。2.2设计用D种验用BBB评分（A）、O（）活、织中A中D和GS-X（680TNFα转录因子（NFB、细胞凋亡（capase-3、Bcl-2、Bax、蛋白质表达（B、iNOS、细胞凋亡数量指。2.3验计计：1每10g雄爪为1，随后依次将左侧腹部，左后爪，头部，腹部，尾部，右前爪，右侧腹部，右后爪，为2，，，5，7，，鼠1至80的查分。（2）。（3）重复有16只D。（4）。组别A葡组B组龙组手组模组

表1B评分记录（s）1d 3d 7d表2AD活性含量变化记表（s）别 A Dd d d d d d葡萄籽花青素治疗组达奉疗组龙组手组模组表4炎（s）别 α 8d d dddd葡萄籽花青素治疗组达奉疗组龙组手组模组表5蛋（s）别 NF7d1d28d葡萄籽花青素治疗组达奉疗组龙组手组模组表7血（s）别 Na+ + Ca2+1d 3d 7d 1d 3d 7d 1d 3d 7d葡萄籽花青素治疗组达奉疗组龙组手组模组（5）统计数据分析本实采计料测各指数，所有均用均数（s示四组行q以05验验表。组B：（1）设H：1=2=3=4（各。H：1、2、3、4不等或不全相等，＝05。（2）计量件S做yA。(3)查F值表，定P值。4、计技线大鼠对照组A手组造模组 B组实组暴露脊髓不打击B评分斜板实验A蛋白质表达,

不给予药物治疗B评分斜板实验A蛋白质表达,

依达拉奉组B评分斜板实验A蛋白质表达,

甲基龙组B评分斜板实验A蛋白质表达,

原花青素组B评分斜板实验A蛋白质表达,技法(1)随机抽样：选正常的D鼠0只，将80只D大鼠体重由小变大编号后，从录于D。(2)实验编号与分组：先每10g为一个重量，若，苦味酸为，尾部，右前爪，右为2，，，，6，，，9鼠1至0，数组。(3)实验手术：抓取手术大鼠，观察其是否健康，有无残疾，如果在手术前，发现前肢有残疾，应做好记录，若残疾出现在后肢，则需要更换老鼠。然后在电子称上称其重量，并做好记录，根据体重严格计算麻醉剂量，采用腹腔注射麻药。大约三分钟左右，大鼠出现站立不稳，醉酒样步态。四肢固定与手术台上，松紧适中，手术过程中注意观察四肢是否出现瘀血，注意按摩。此时，可用大头针刺激大鼠尾巴，如果大鼠的反应不强烈，预示着可以开始手术。首先剪除大鼠胸椎区域毛，而后均匀喷洒碘伏溶液两倍备皮区域。在大鼠背部脊柱有一个圆盘状突起，经过鼠T2的棘与T1起区域剖开皮肤2－3cm，逐步暴露浅筋膜、肌肉直到椎骨。(4)模型复制：用手术刀小心去除T9椎骨上的肌肉。随后进行椎板切除术，用有齿镊剥离9棘两侧锥板以获得良好显露，用脊髓打击器按25mm打击暴露脊髓，打击后即刻见大鼠双后肢发生动功。(5）处理措施：①葡萄籽素组剂P腔剂S0gg量注一剂组：P腔剂0g的。(mg6m-8g/l--体（g）/200 ml---)②依达拉奉治疗组：依达拉奉3·g的剂量用．，每隔12h射为0n共d。×0.02 )：后量0g／g后54g／(kg·h4h，分腔。(gl--模重kg/0.4l时重×2.65)④造模组：损伤后不。⑤假：手。()取材：电针1d、、d、d和2d组4以1%后开胸暴露心脏和升主动脉，将灌注插管经左心室插入升主动脉，固定插管剪开右心房。快速灌注冰生冲肝白即换注10～20前1/3速注后2/3缓除70棘突和取1cm损伤区域脊髓组织横厚5µ（µ分行HE疫织检。()指标检测：B分：于术后1d、d、d、7d、10d、14d、d、2d动，采用双人双盲法观后BB分[17]。2斜板试验：以Mol斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。以术后斜板维持率（术后板角度前%衡功。血中、NO和：于术后d、、d经右心血l即300n离心为3于01周分析完毕。测定仪器为DO和A测盒O含定硝还法，A按比定D作说进。血清中炎性因子含量测定后1d7d血l即3000n心1n，上液,存于0定Tα68及IL-10剂）[19]。蛋白质表达：疗d、d和d，分取组4只大鼠，注10～20，前1/3快后2/3缓慢灌除T7T0和取m厚µ白细胞素（8子（Tα学SACB镜察[20]组取5切取4个国Leiea5W用ImageProPlus5.0微图像分析软件进行分析[20]。细胞凋亡取2张别行2a3和Bax检测人Bc2、鼠Cs-3多克抗兔小鼠x抗、CDABB色剂。免疫组化检测采用SABC和B用OlympsCH30光和B200选6野(积×1m)角3角3计算各个视野的阳性细胞个数[17。6脊在取0g湿重脊髓组织，于45烤5d至重干下髓一重)重x0％7L组2TUEL法标记DAB400光镜下每张切数5个视野共2500。8NF-B和水,炉8原复n后片,的3%2溶.1mol·1PBS冲洗3次。分抗NFκBp65、兔抗I(C-2)抗iNO为10，7、h后置4夜,用01·1PBS洗3链苯细。9脊髓组织中AGX测取织g水制成为1％的组织匀,000r/n离心取上液0.l进行检测NO含量测定采用还酶D含量测定采法A用DB测定GX。析1、D大鼠易得到，。2。果1、葡萄籽花。2。（五）实验设计工作时间安排1、共计1d完成分组号2、共计5d成制3、共计34d完验件1、仪器设备情况注A和D离机灭打68及IL-10分GA-3经和c3、B2和Bax免组抗等。2、实验动物情况：健康SD鼠4只。3、药品试剂来源素、依达拉奉、甲基松龙针剂、多聚甲醛戊巴比妥钠7%、、钠。参文献：[1]李莹,药立波,韩炯.葡萄籽提取物原花青素诱导胃癌细胞脱落调亡[J].中国药理学通报,20,07:6-64.[2]FriE,BertaniM,ustchG,ta1PrcesforpreparinggrapeseedecsenrichedinpocaiollgmesF]uiedSttsPatn,99,.umbr54854.[3]高军涛,HuiruTang,侯京武,等.葡萄籽中多酚类物质对氯自由基清除作用的ESR研究[J].波谱学杂志,19,65:0-15.[4]BagchiD,BagchiM,StohsSJ,eta1.Freeradicalsandgrapeseedproanthocyanidinextract:importanceinhmanhathaddiesepeeto.Fcclgy2001823:8-9.[5]SatoMBghiDTskiA,ta.reRaieBolMd20;16:2-3.[6]PatkiT,akIKoasP,eta.mJCln Nut,002755)89489.[7]VinonJA,MnaaoMAhata1.eeiilefecsofanl6 gpeditdadmnarslllBohm,022012:-03.[8]王蕾,买买提祖农·买苏尔,克拉·阿巴斯,等.葡萄籽原花青素对大鼠肾缺血再灌注损伤保护作用的研究[J]报,01,3()86.[9]陆景红,任明山,李光武,等.葡萄籽原花青素对脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国临床康复,20,5)9-0.[10]陈荣志,陆景红,任明山等.葡萄籽原花青素对大鼠脑缺血再灌注后NFB、IB和NS的影响[J.药志,0,(:66.[11]IWengunZHNGXio-uWuYgetannmryefctandmofoa-hcaiisfrmgraesed[]AtaPamaolSn,20,21)l1-12.[12]BlazsG,GborM,RohdewaldP.Antiinflammatoryactivitiesofprocaniin-onaiingexratsmPnspinserAtatrorlandctneusapiainJ.hamze1975()30-8.[13]王峰郭健.原抗究[