耳叶苔毕业设计论文

摘要：psbA基因编码的D1蛋白是光系统Ⅱ（PSⅡ）的重要组成部分，参与维持PSⅡ反应中心构象的稳定和电子的传递。以耳叶苔科植物的psbA基因序列作为研究材料，通过预测耳叶苔科各物种间的分化时间，推测可能影响其进化的外部因素；应用位点模型、分支模型、分支位点模型以及FEL模型对psbA基因进行适应性进化分析，检测可能受到正选择的位点，为D1蛋白的结构和功能研究提供参考信息。研究结果显示耳叶苔科植物最早的分化发生在距今约121Ma年前，进入新生代分化速度明显加快，推测与被子植物的兴盛有关；通过适应性进化分析，在D1蛋白中检测到4个正选择位点，30个高度保守的位点，研究结果再一次验证了psbA基因高度保守的特性。关键词：耳叶苔科；psbA基因；分歧时间；适应性进化；DivergenceTimeEstimationandAdaptiveEvolutionAnalysisofFrullaniaceae收稿日期:收稿日期:修改稿收到日期：基金项目：作者简介：孙君波(1986-)，男（汉族），硕士生，专业方向：植物学。E-mail:dxxsjb@163.com通讯作者：苏应娟(1965-)，女，博士，研究方向：进化遗传学。TelE-mail:suyj@Abstract:D1proteinencodedbypsbAgeneisanveryimportantcomponentofPhotosynthesisSystemⅡ(PSⅡ)andcontributestothestabilityofPSⅡ’sreactioncenterandelectrontransfer.ThedivergencetimeisestimatedusingpsbAgeneofFrullaniaceae,theadaptiveevolutionofpsbAgeneisalsoanalyzedundersitemodel,branchmodel,branch-sitemodelandFELmodel,respectively.Theresultshowsthatthefirstdivergenceeventhappenedabout121Maago,thespeedofdivergenceacceleratedafterCenozoic;Foursiteswerefoundedunderpositiveselectionwhilethirtysitesundernegativeselectionandnositewasfoundedtoexperiencedcoevolution.TheresultofourresearchisanotherevidenceofthehighlyconservativeofpsbAgene.Keywords:Frullaniaceae;psbAgene;divergencetime;adaptiveevolution;coevolution在相当长的一段时间里，人们普遍认同这样一种观点：白垩纪被子植物的兴起伴随着包括蕨类植物在内的众多非种子维管植物多样性和丰富度的急剧下降。Schnelder等基于化石记录利用分子钟重新估算了被子植物和蕨类各自的分化时间，研究结果表明现存的绝大多数蕨类植物的分化发生在白垩纪被子植物繁盛之后，即蕨类在适应由被子植物提供的新的生境的过程中发生了物种的“辐射式”增长。之后对水龙骨科附生蕨类rbcL基因的适应性进化分析表明蕨类植物的确可以通过功能基因的进化达到适应外界新环境的目的。苔藓植物是一类与蕨类具有相似起源与进化历史的植物类群，对蕨类的研究结果提示我们苔藓植物在进化过程中极有可能也经历了类似的物种快速分化的阶段。耳叶苔科（Frullaniaceae）是苔类植物中较大的一科，包括毛耳苔属（Jubula）和耳叶苔属（Frullania）。现存的耳叶苔科植物约有800多种[1-2]，主要分布于热带、亚热带地区，其生活方式以附生为主。由于在水分、光照等方面存在较大差异，推测耳叶苔科各物种在进化过程中相关的功能基因会发生适应性进化，尤其是与光合作用相关的基因。光系统Ⅱ（PSⅡ）定位于叶绿体的基粒类囊体膜上，是光反应“Z”链上的第一个蛋白-色素复合体，同时也是自然界中唯一一个能将水分子分解成氢和分子氧的复合体。PSⅡ主要负责光能的吸收、传递和转化，在光合作用过程中发挥重要作用。psbA基因编码的D1蛋白是构成PSⅡ反应中心的核心蛋白之一，与D2蛋白共同构成了PSⅡ的基本骨架；D1蛋白也是PSⅡ中一个重要的功能蛋白亚基，直接能与了光合作用过程中原初电荷的分离与电子传递，因此，D1蛋白在结构上发生的任何改变都有可能极大的影响PSⅡ的结构与功能，进而影响光合作用的效率。因此在时间框架下对psbA基因进行适应性进化分析将有助于进一步阐明光合作用中功能基因适应性进化的机制。生物进化就是生物与环境之间相互作用并导致遗传系统与表型发生一系列不可逆改变并不断适应环境的过程（杨继等.植物生理学，高等教育出版社）。在分子水平上进行适应性进化分析可以为蛋白的结构和功能研究提供重要的参考信息。尤其是1962年Zuckerkandl提出分子钟假说之后，人们可以在时间框架下研究生物的进化历史，并将生物的进化与地质史上的重大事件联系起来，有助于深入理解环境变迁影响生物适应性进化的机制。经过近五十年的发展与完善，如今的“分子钟”假说已经较好的解决了不同谱系间分子异速进化的问题，即使在缺少化石资料的情况下也可以很好的估计物种的分歧时间，这为研究早期物种的适应性进化提供了契机。鉴于psbA基因在光合作用中的重要作用以及GenBank中已经收录了大量的psbA基因全序列，本研究选取110种耳叶苔科植物的psbA基因全序列进行适应性进化分析，目的在于：（1）通过估计耳叶苔科各物种的分化时间，推测可能影响其进化的地质事件；（2）检测psbA基因各位点在进化过程中承受的选择压力，进而推断在维持D1蛋白结构、功能以及适应环境方面发挥重要作用的位点，为D1蛋白的结构功能研究提供参考资料。1、材料和方法1.1序列数据从GenBank下载110种耳叶苔科植物以及6种作为外类群的细鳞苔科植物的psbA基因全长序列(表1)。应用ClustalX2.0软件[9]对序列进行多重比对并加以手工校正；编辑后的序列矩阵中，每条序列包含有1059个核苷酸，353个密码子。本文中氨基酸位点编号参照Lejeuneapallescens（ABL86495）的编码。耳叶苔科系统发育重建与分歧时间估计运行Modeltest3.7软件选取最优的核苷酸进化模型。根据Modeltest选取的GTR+I+G模型设置似然模型参数，用Mrbayes3.1.2软件经贝叶斯途径构建系统发育树。系统发育模型的后验概率依据Mropolis-Hastings-Green算法通过4条链（MarkovChainMonteCarlo,MCMC）运行15000000代估计。MCMC分析以随机树起始，每100代保存1棵树，使用Tracerv1.4.1软件[12]检验各参数的收敛程度。最初的37500棵树被当作老化样本摒弃，以剩余样本构建系统发育树。采用BEASTv1.5.3软件[10]中的UCLD（UncorrelatedLognormalDistributedRelaxedClockModel）分子钟模型估算各分支的分歧时间，利用最近共同祖先时间（Tmrca，themostcommonancient）对各分支的分歧时间加以校正。根据Modeltest3.7软件[11]选取的核苷酸替换模型设定MCMC运算的参数，迭代运算30000000代，每1000代保存1株样本；利用Tracerv1.4.1软件[12]检验各参数的收敛程度。将最初的7500棵树作为老化样本摒弃，用剩余样本重建时间尺度下的一致树。表1植物材料及其psbA基因GenBank登录号Table1PlantmaterialsandtheirpsbAgeneGenBankaccessionnumbers中文名Chinesename学名SpeciesnameGenebank登录号Accessionnumber-FrullanoidesmexicanaSlageren.EF011851-FrullaniaaculeataTaylorFJ380698喙尖耳叶苔FrullaniaacutilobaMitt.FJ380572-Frullaniaaff.neurotaCosta&GradsteinFJ380637-FrullaniaamplicraniaSteph.FJ380599-FrullaniaampulliferaJ.B.Jack&Steph.FJ380561-FrullaniaanderssoniiAngstrom.FJ380558-FrullaniaangulataMitt.FJ380703-FrullaniaanomalaE.A.Hodgs.FJ380611-FrullaniaapicalisMitt.FJ380695尖叶耳叶苔Frullaniaapiculata(Reinw.,Blume&Nees)Dumort.FJ380681折扇耳叶苔Frullaniaarecae(Spreng.)GottscheFJ380624-FrullaniaarmitianaSteph.FJ380676-Frullaniaaterrima(Hook.f.&Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380680-Frullaniaatrata(Sw.)Dumort.FJ380687-FrullaniaazoricaSim-Simetal.FJ380586缅甸耳叶苔FrullaniaberthoumieuiiSteph.FJ380563细茎耳叶苔FrullaniabolanderiAustin.FJ380671-FrullaniabrasiliensisRaddiFJ380700-FrullaniabrittoniaeA.Evans.FJ380592-Frullaniacalifornica(AustinexUnderw.)A.EvansFJ380658-Frullaniacf.madothecoidesDavisAY607942-Frullaniachevalieri(R.M.Schust.)R.M.Schust.FJ380616-Frullaniacongesta(Hook.f.&Taylor)Hook.f.&TaylorexGottscheetal.FJ380645-FrullaniacuencensisTaylorFJ380636-FrullaniadeplanataMitt.FJ380568-FrullaniadepressaMitt.FJ380634-Frullaniadiptera(Lehm.)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380570-FrullaniaduthianaSteph.FJ380593-FrullaniaeboracensisGottscheAY688827-Frullaniaeboracensissubsp.Parvistipula(Steph.)R.M.Schust.FJ380588-Frullaniaecklonii(Spreng.)Spreng.FJ380622皱叶耳叶苔Frullaniaericoides(NeesexMart.)Mont.FJ380550波叶耳叶苔FrullaniaeymaeS.Hatt.FJ380562-FrullaniafalcilobaTaylorexLehm.FJ380544-FrullaniafengyangshanensisR.L.Zhu&M.L.SoFJ380596-Frullaniaferdinandi-muelleriSteph.FJ380575-Frullaniafragilifolia(Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380667-Frullaniafugax(Hook.f.&Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380609-FrullaniafulfordiaeS.Hatt.FJ380608暗绿耳叶苔芽胞变种Frullaniafuscovirensvar.gemmipara(R.M.Schust.&S.Hatt.)S.Hatt.&P.J.LinFJ380590短瓣耳叶苔Frullaniagaudichaudii(Nees&Mont.)Nees&Mont.(Ⅰ)FJ380665-FrullaniagibbosaNeesFJ380638-Frullaniaglomerata(Lehm.&Lindenb.)Nees&Mont.FJ380613-Frullaniagracilis(Reinw.,Blume&Nees)Dumort.FJ380674-FrullaniagrossiclavaSteph.FJ380656-FrullaniahamataSteph.FJ380651-FrullaniahattoriivonKonrat&BragginsFJ380678-FrullaniaholostipulaS.Hatt.&D.G.GriffinFJ380627-FrullaniahoweanaSteph.FJ380559细瓣耳叶苔FrullaniahypoleucaNeesFJ380639-FrullaniaincumbensMitt.FJ380610石生耳叶苔FrullaniainflataGottscheFJ380670-Frullaniaintermedia(Reinw.,Blume&Nees)Dumort.FJ380652-Frullaniaintumescens(Lehm.&Lindenb.)Lehm.&Lindenb.FJ380690-FrullaniajackiiGottscheFJ380595-FrullaniakunzeiLehm.&Lindenb.FJ380697-Frullanialobulata(Hook.)Dumort.FJ380619-FrullaniamagellanicaF.Weber&NeesFJ380618-FrullaniameyenianaLindenb.FJ380693-FrullaniamicrocaulisGolaFJ380620-Frullaniamicrophylla(Gottsche)PearsonFJ380668-FrullaniamirabilisJ.B.Jack&Steph.FJ380685列胞耳叶苔Frullaniamoniliata(Reinw.,Blume&Nees)Mont.AY507484-Frullaniamonocera(Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380574-FrullaniamoritzianaLindenb.&GottscheFJ380691-FrullaniamultilaceraSteph.FJ380673尼泊尔耳叶苔Frullanianepalensis(Spreng.)Lehm.&Lindenb.FJ380580厚角耳叶苔Frullanianodulosa(Reinw.,Nees&Blume)NeesFJ380650-FrullaniaobcordataLehm.&Lindenb.FJ380641-FrullaniaobscurifoliaMitt.FJ380604-FrullaniapatulaMitt.FJ380567-FrullaniaperuvianaGottscheFJ380704-FrullaniapittieriSteph.FJ380692-FrullaniaplanaSull.FJ380583-FrullaniapolystictaGottsche,Lindenb.&NeesFJ380660-FrullaniaptychanthaMont.FJ380644-FrullaniapurpureaSteph.FJ380672-FrullaniareflexistipulaSandeLac.FJ380573-FrullaniaregularisSchiffnerFJ380654-FrullaniarepandistipulaSandeLac.FJ380646-FrullaniareptansMitt.FJ380603褶瓣耳叶苔Frullaniariojaneirensis(Raddi)SpruceFJ380628-FrullaniaripariaHampeexLehm.FJ380598-Frullaniarostrata(Hook.f.&Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380615齿叶耳叶苔FrullaniaserrataGottscheFJ380683-FrullaniasheanaS.Hatt.FJ380675-FrullaniasolanderianaColensoFJ380614-Frullaniasp.Pocs&PocsFJ380679-FrullaniasphaerocephalaSpruceFJ380621-FrullaniaspiniferaTaylorFJ380560-FrullaniaspinigastriaS.Hatt.FJ380566-Frullaniasquarrosula(Hook.f.&Taylor)Hook.f.&TaylorexGottscheetal.FJ380547-FrullaniasubcaducaS.Hatt.FJ380597-FrullaniasubdentataSteph.FJ380682-FrullaniasubincumbensS.Hatt.FJ380605-Frullaniasubnigricaulisvar.subtruncataS.HattFJ380565-FrullaniasubrostrataS.Hatt.FJ380677欧耳叶苔Frullaniatamarisci(L.)Dumort.AM396284-Frullaniatamariscisubsp.asagrayana(Mont.)S.Hatt.FJ380657-Frullaniatamariscisubsp.Nisquallensis(Sull.)S.Hatt.FJ380661塔拉大克耳叶苔FrullaniataradakensisSteph.FJ380591-FrullaniatetrapteraNees&Mont.FJ380633-Frullaniatrinervis(Lehm.)Lehm.&Lindenb.FJ380647-FrullaniausamiensisStephFJ380589-JubulabogotensisSteph.AM396281毛耳苔Jubulahutchinsiaesubsp.javanica(Steph.)Verd.AY507492-Jubulahutchinsiaesubsp.pennsylvanica(Steph.)Verd.AY607954-LejeuneacancellataNees&Mont.exMont.EF011810-Lejeuneacavifolia(Ehrh.)Lindb.Emend.BuchAM396279-LejeuneacerinavoucherWilsonetal.EF011820-LejeuneacladogynaEvansAY607958-Lejeuneaflava(Sw.)NeesEF011789-LejeuneapallescensMitt.EF011772-Lejeuneapaucidentata(Steph.)GrolleEF011826-NipponolejeuneapiliferaAM396291-NipponolejeuneasubalpinaAM3962901.3序列变异程度分析用BioEditversion[35]将核苷酸序列翻译成相应的氨基酸序列并进行比对。根据公式H(l)=-Sf(b,l)ln(f(b,l))计算各氨基酸位点的熵值（Entropyvalue）并绘制熵图（Entropyplot）。每个位点的熵值与其他位点的状态无关，只取决于该位点上各类氨基酸残基出现的频率。熵值的大小反映该位点变异程度的高低[36,37]。1.4适应性进化分析采用进化分析软件PAML4.1[13]中的位点模型、分支模型以及分支-位点模型（A模型）分析耳叶苔科D1蛋白各位点在适应性进化过程中经受的选择压力：位点模型假定系统树不同分支所经受的选择压力相同，但同一分支上的不同氨基酸位点经受的选择压力不同。本研究选用位点模型中的3对模型：M0(单比率模型)和M3(离散模型)、M1a(近中性模型)和M2a(正选择模型)以及M7(beta模型)和M8(beta&ω模型)[14-15]。其中模型M0、M1a以及M7是空模型，假设条件中不允许ω>1，而模型M2a、M3以及M8的假设条件允许ω>1。模型M2a、M3以及M8和他们各自的空模型（M0、M1a以及M7）是相互嵌套的，可以对它们进行似然比检验(likelihoodratiotest,LRT),检验统计量为2∆ℓ(∆ℓ=ℓ1－ℓ0，ℓ1、ℓ0分别表示两个模型下的最大似然值)，依χ2分布检验其显著性,自由度为两个模型参数数目的差值。分支模型[15,16]允许不同分支所经受的选择压力不同。其中单比率（one-ratio）模型是最简单的模型，假设进化树上所有分支经受的选择压力相同，即所有分支具有相同的ω值；自由比率（free-ratio）模型假设不同的分支经受不同的选择压力，即不同分支具有不同的ω值。分支-位点模型[17,18]中的A模型把所有分支分为两类：前景分支和后景分支，只有前景分支可能受到正选择作用。该模型中假设存在四类位点：0类位点在所有分支中都是保守的，其ω值（ω0）介于0到1之间；1类位点在所有分支中受到中性选择的作用，其ω值（ω1）等于1；2a类位点在背景分支中受到负选择，但在前景支中受到正选择；2b类位点在背景支中受到中性选择，但在前景支中受到正选择。该模型包括两种似然比检验：检验1和检验2，根据Yang的建议，本研究采用检验2[13]。此外，将耳叶苔科psbA基因序列提交在线服务器Datamonkey（/）[19]采用FEL（FixedEffectsLikelihoodmodel)模型分析各氨基酸位点经受的选择压力。最后将序列信息提交在线服务器SWISS-MODEL（/repository/）进行同源建模[21-23]。2结果2.1耳叶苔科系统发育重建与分歧时间估计图1为基于贝叶斯法构建的耳叶苔科各物种psbA基因的系统发育关系。由构建的系统发育树可以看出，耳叶苔科较明显的分为两大支（后验概率为1.00）：第一支由毛耳苔属的JubulabogotensisSteph.、Jubulahutchinsiaesubsp.javanica(Steph.)Verd.和日鳞苔属的Nipponolejeuneapilifera、Nipponolejeuneasubalpina组成，这与JörnHentschel等[24]所报道的一致；第二支由毛耳苔属Jubulahutchinsiaesubsp.pennsylvanica(Steph.)Verd.和所有耳叶苔科的物种组成。其中Jubulahutchinsiaesubsp.pennsylvanica(Steph.)Verd.处于基部位置。为准确估计耳叶苔科各主要支系的分歧时间，本研究采用JochenHeinrichs等[25]报道的日鳞苔科与耳叶苔科的分歧时间进行单点校正。分析结果显示，耳叶苔科第一次分化发生在约121百万年前，进入新生代（约65.0百万年前）之后分化速度明显加快，分析可能是与白垩纪被子植物的兴盛以及古新世-始新世最热地质事件有关。图1基于耳叶苔科psbA基因序列数据和UCLD分子钟模型构建的系统发育树Fig.1ThephylogenetictreeofFrullaniaceaeestablishedfrompsbAgenesequenceswithuncorrelatedlognormaldistributedrelaxedclockmodel2.2序列变异程度分析图2耳叶苔科D1蛋白各位点的熵值图Fifure2EntropyplotforaminoacidresiduesinD1proteinofFrullaniaceae图2为耳叶苔科D1蛋白各位点的熵值图。熵值为零表示该位点高度保守，熵值越大说明该位点发生的改变越多，变异程度越高。由图我们可以看出耳叶苔科psbA基因中大部分位点是高度保守的，只有少数的位点在进化过程中发生了改变。经统计，全长为353个残基的D1蛋白前体共有18个位点发生了变异，占序列全长的5.1%；其中有6个位点位于C末端的非功能区，该区域只存在于D1蛋白前体中，在成熟D1蛋白中被剪切除去[5]；其他12个变异位点则分散分布在D1蛋白的功能区中。这些变异位点的变异程度普遍较低（熵值介于0.04和0.35之间），只有位点30I和155T的变异度较高（熵值分别为0.66781和0.64956）。2.3耳叶苔科psbA基因正选择位点的鉴定用PAML4.0b10软件计算得耳叶苔科psbA基因在位点模型、分支模型以及分支-位点模型下的对数似然值和各参数估计值（表2）。在位点模型中，第一对模型M0-M3用于检测作用于各位点上的选择压力是否存在差异。模型M3的似然值ℓ=-3907.386458，模型M0的似然值ℓ=-3985.506892，似然比检验统计量2Δℓ=156.240868，明显大于d.f.=4、P=95%时χ2检验的临界值9.49，模型M3统计上显著优于M0（表3），由此可推断耳叶苔科psbA基因各位点上经受的选择压力显著不同，即不同位点的ω值显著不同。模型M2a以及M8的假定条件中均允许ω>1，并同时检测到同一个氨基酸位点，即155T（P>99%），受到正选择，LRT检验结果显著。在分支模型中，通过比较自由比率模型和单比率模型共检测出A、B、C三个分支可能发生正选择(图1)，其ω值均为999.00。在分支-位点模型中分别以这三个分支作为前景分支进行分析，结果只在分支A和分支C检测到一个正选择位点：19N。但在随后的LRT检验中，分支A和分支C的检验统计量2Δℓ分别为0.423062和0.422382，均小于d.f.=4、P=95%时χ2检验的临界值3.84，检验结果并不支持位点19N是一个统计上显著的发生正选择的氨基酸位点，推测可能是由于前景分支选择压力放松造成的假阳性结果。表2各类位点间可变ω比值模型下的参数估计值和对数似然值Table2Parameterestimatesandlog-likelihoodvaluesundermodelsofvariableωratiosamongsites模型Modelsnp似然值ℓ参数估计值Estimatedvalueofparameters正选择位点Positiveselectionsites位点模型SitemodelsM0（单一比值）M0：Oneratio175-3985.506892ω=0.02650无NoneM1a（近中性）M1a：Nearneutral176-3933.082580p0=0.97603,ω0=0.02397P1=0.00810,ω1=1.00000不允许NotallowedM2a（选择）M2a：Positiveselection178-3924.066915p0=0.97656,P1=0.02060，P2=0.00284ω0=0.00844,ω1=1.00000ω2=6.08838155T**M3（离散）M3：Discrete179-3907.386458p0=0.92026,p1=0.07690,p2=0.00284ω0=0.00000，ω1=0.23603，ω2=5.74112155T**M7（beta）M7：beta176-3928.684116p=0.00500，q=0.10114不允许NotallowedM8（beta&ω）M8：beta&ω178-3907.890409p0=0.99716，p=0.01082，q=0.26453,p1=0.00284，w=5.74080155T**分支模型Branchmodels单比率（one-ratio）175-3985.506892ω=0.02650无None自由比率(free-ratio)347-3925.532334ωA=999.0000，ωB=999.0000，ωC=999.0000无None分支-位点模型Branch-sitemodels分支a零假设A0NullmodelA0177-3929.967965p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000ω0=0.00812，ω1=1.00000，ω2=1.00000不允许Notallowed备选假设AAlternativemodelA178-3929.756434p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000ω0=0.00812，ω1=1.00000，ω2=84.3396919N（0.755）分支b零假设B0NullmodelB0177-3932.680023p0=0.97597，p1=0.02403，p2a+p2bω0=0.00811，ω1=1.00000，ω2=1.00000不允许Notallowed备选假设BAlternativemodelB178-3932.680023p0=0.97596，p1=0.02404，p2a+p2b=0.00000ω0=0.00811，ω1=1.00000，ω2=1.00000无None分支c零假设C0NullmodelC0177-3929.970251p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000ω0=0.00812，ω1=1.00000，ω2=1.00000不允许Notallowed备选假设CAlternativemodelC178-3929.759060p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000ω0=0.00812，ω1=1.00000，ω2=96.2103919N(0.873)此外，位点模型检测到大量的负选择位点，说明耳叶苔科植物的psbA基因非常保守。模型M0由序列数据估计得各位点的平均ω值为0.0265，表明净化选择在psbA基因的进化过程中起主导作用。模型M2a和M8均允许位点受到正选择作用，在统计上也显著优于它们各自对应的空模型M1a和M7。模型M2a的结果显示psbA基因中有97.7%的位点受到负选择的作用（ω=0.00844）。同时模型M8也检测到99.7%的位点处于负选择压力下。所有的分析结果均支持耳叶苔科psbA在进化上是高度保守的。表3似然比值检验统计量（2Δℓ）Talbe3Likelihoodratiostatistics(2Δℓ)模型比较Comparion2Δℓ2Δℓ自由度d.f.位点模型SitemodeM0vs.M3156.24086849.49M1avs.M2a18.03133025.99M7vs.M841.58741425.99M8vs.M8a22.24697613.84分支模型BranchmodelM0vs.F119.949116172206.87分支-位点模型Branch-sitemodelA0vs.A0.42306213.84B0vs.B0.00000013.84C0vs.C0.42238213.84.注：np表示模型中参数的数目；“*”和“**”分别表示在95%和99%水平上检测到的正选择位点。Note:npstandsforthenumberofparametersindifferentmodels.“*”and“**”standforthepositivelyselectedsitedwerefoundedunder95%and99%crediblelevel,respectively.应用在线分析软件Datamonkey的FEL模型分别检测P=0.1、P=0.05、P=0.01时psbA基因上的选择压力变化。P=0.1时共检测到4个正选择位点（155T、203I、345A、351V）和84个负选择位点；P=0.05时共检测到1个正选择位点（155T）和65个负选择位点；P=0.001时检测到1个正选择位点（155T）和30个负选择位点（图3A）。在FEL模型下检测到的正选择位点的ω值都接近于无限大，统计结果显著，表明这些位点几乎没有发生同义替换（图3B）。除检测到正选择位点外，在P=0.1、P=0.05、P=0.01时还分别检测到84、65、30个高度保守的位点（分别占氨基酸残基总数的23.80%、18.41%、8.50%），推测这些保守位点与维持D1蛋白的结构和功能有关，表明耳叶苔科AB图3耳叶苔特psbA基因在Datamonkey中的分析结果A:Datamonkey检测到的正负选择位点数；B：30个高度保守位点的dN以及dS值Figure3TheDatamonkeyanalysisresultforthepsbAgeneofFrullaniaceaeA:ThenumbersofnegativelyandpositivelyselectedsitesinDatamonkey;B:ThedNanddSvaluesof30highlyconservedsites.2.4正负选择位点的定位由SWISS-MODEL预测得到D1蛋白第10到344号位点的三维结构，用Raswin软件将检测到的正选择位点和高度保守位点在三维结构上进行定位。正选择位点155T和203I分别定位在跨膜α-螺旋B和D上(图4)，另两个正选择位点345A和351V位于C末端的九个氨基酸残基的延长区（该区域在成熟的D1蛋白中被切除）。将FEL模型检测到的30个高度保守的位点在D1蛋白的三维结构上进行定位发现，这些位点大多在维持D1蛋白的结构稳定和电子的传递方面扮演重要的角色。有11个位点（33F、115I、130E、132E、133L、162P、163I、205V、270S、271L、286T）定位在跨膜α-螺旋上（图5），由此可见这些跨膜α-螺旋对于维持D1蛋白结构和功能非常重要；另有8个位点（77I、130E、228T、252H、263A、270S、271L、323R）是D1蛋白与D2蛋白间发生相互作用的位点；另有两个位点（252H、271L）还参与了QB结合“口袋”的形成，而QB在D1蛋白上的结合位点正是多种有机农药的作用位点，这些位点的突变与植物各种抗性特征的形成有关[33]。其他的位点参与了D1蛋白膜两侧结构域的形成，可能在维持D1蛋白结构和电子的快速传递方面发挥作用。图4psbA基因编码D1蛋白三维结构以及正选择位点的空间位置（基质侧在上，类囊体腔侧在下）Figure4The3-DstructureofD1proteinencodedbypsbAgeneandthepositionforthepositivelyselectedsites(Thecytoplasmicsideisontop,thelumenalsideonthebottom).图5psbA基因编码D1蛋白比对结果(用红色阴影标出部分表示五处跨膜结构域，分别用H1、H2、H3、H4、H5表示)。Figure5ThealignmentresultforD1proteinencodedbypsbAgene(Fivetransmembraneregionsarehighlighted,signedbyH1、H2、H3、H4、H5,respectively)3讨论本研究利用已报道的耳叶苔科与细鳞苔科的分歧时间（155.9±10.3百万年前）进行单点校正，估计得耳叶苔科psbA基因第一次分化事件，即毛耳苔属和耳叶苔属的分化，发生在距今约121百万年的白垩纪。进入新生代（约65.0百万年前）之后分化速度明显加快，尤其是渐新世中期（距今约30.0百万年），耳叶苔科的丰富度呈现出“辐射性”增长的趋势。这促使我们不得不思考这样一个问题：促使耳叶苔科发生这种物种“辐射式”增长的动力是什么呢？Schneider[29]等的研究认为，在白垩纪被子植物的繁盛导致陆地生态系统发生显著变化。为应对被子植物引起的陆地生态系统的变化，蕨类植物在白垩纪发生物种的“辐射式”分化。苏应娟等对水龙骨科附生蕨类Rubisco大亚基的研究也验证了这一点。由此我们可以推测，白垩纪被子植物兴起后也改变了耳叶苔科植物生存的环境，再加上高达的被子植物本身也为附生其上的耳叶苔植物提供了复杂的生存环境（树干的不同部位光照强度和水分条件存在显著差异），这极有可能导致耳叶苔科植物经历与蕨类植物相似的物种进化过程。另外，耳叶苔科植物物种的“辐射式”增长与当时地球的气候变化关系密切。进入新生代之后，地球上曾发生许多重大的地质事件[26]，比如古新世—始新世最热事件(PETM，Paleocene-EoceneThermalMaximum)、渐新世初大冰期事件(EOGM，theEarliestOligoceneGlacialMaximum)以及中中新世变冷事件等，导致地球上的气候发生很大波动。古新世-始新世最热事件(PETM)，又被称为晚古新世最热事件(LPTM，LatePaleoceneThermalMaximum)[27]，是指古新世末始新世初（约55百万年前），全球平均气温在很短的时间内升高4-8℃的地质事件。温度的迅速升高直接导致全球的动、植物分布和丰富度发生大幅度波动[28]。全球气温上升使得高纬度地区的生态环境变得更适合植物生长，原本分布于热带、亚热带的植被，尤其是较高等的被子植物，开始向高纬度地区扩张。作为先锋物种，被子植物先一步进入新的环境，为附生在其枝干上的耳叶苔科植物向高纬度扩张创造了条件[2,29]。在渐新世初期（大约34Ma年前），全球气候开始由温暖湿润向寒冷干燥转变[30,31]，这对各种植物对环境改变的适应能力是一种严峻的考验。一些不适应这种气候变化的植物类群或者向低纬度地区退缩，或者通过进化适应这种寒冷的气候，进而形成新的物种。耳叶苔科虽然是一类较低等的植物类群，但对温度的波动和干旱有一定的抵抗能力，我们推测耳叶苔科极有可能通过演化适应了这种“恶劣”的环境，进而发生了物种的快速分化。因此我们推测，进入白垩纪之后，被子植物的繁盛为低等的耳叶苔科植物提供了复杂多样的生存环境，再加上新生代之后一系列重大地质事件所导致的地球气候剧烈波动的影响，耳叶苔科发生了物种的“辐射式”增长（苏老师等人的文章）。序列变异分析显示耳叶苔科D1蛋白是高度保守的，353个氨基酸残基中只有18个（占序列全长的5.1%）发生变异，其中只有12个位点位于功能结构区且变异度都不高。PAML和Datamonkey的分析结果也显示D1蛋白是高度保守的。其中PAML位点模型中的M2a模型检测到D1蛋白中97.7%的位点高度保守（ω<0.1），Datamonkey中的FEL模型也检测到30个（P=0.001）高度保守的位点，说明净化选择在耳叶苔科psbA基因的进化过程中起主导作用。通过D1蛋白三维结构的分析发现，本研究中检测到的保守位点大都与D1蛋白生理功能的正常行使有关。比如D1蛋白上的次级电子受体QB结合区主要由D和E跨膜α-螺旋之间的位点组成，该区域所有位点的ω值均小于1；位点161Y和190H直接参与了光合作用过程中的水的光解，这两个位点的ω值均小于0.1；Datamonkey检测到的30个高度保守位点中有12个位点（33F、115I、130E、132E、133L、162P、163I、205V、228T、270S、271L、286T）位于跨膜α-螺旋上，有8个位点（77I、130E、228T、252H、263A、270S、271L、323R）是D1、D2蛋白之间相互作用的部位，这些位点对维持PSⅡ的结构和功能稳定具有重要作用。耳叶苔科psbA基因之所以如此高度保守，可能是由以下原因导致的：（1）psbA基因在耳叶苔科中是单拷贝基因，在光合作用中发挥着不可替代的作用。在漫长的演化过程中psbA基因也会发生突变，但这些突变往往是有害的。由于PSⅡ功能的损失得不到补偿，植物光合作用的效率就会降低甚至完全丧失，自然选择就会把这些有害变异从种群中清除；psbA基因也有可能发生有利突变，但是受到遗传漂变等非定向选择作用的影响，这部分有利变异丢失，所以psbA表现的高度保守；（2）耳叶苔科有可能是通过生理功能或形态结构上的改变达到快速适应复杂多变的环境的目的[38-39]，因此在基因水平上找不到耳叶苔科发生适应性进化的证据；（3）基于密码子替换模型，利用ω>1作为判断正选择的标准只能检测到非同义突变统计上显著高于同义突变的正选择位点。而psbA基因是一个非常古老的基因，其适应性进化有可能发生在早期并被固定下来，那么利用现存的基因序列作为研究材料，就无法准确鉴定出在其“祖辈”中发生了适应性进化并被固定下来的正选择位点。参考文献：[1]胡人亮.苔藓植物学[M].上海:高等教育出版社,1987.[2]吴彦君,于晶,曹同.8种耳叶苔属植物的孢子形态及壁层结构电镜观察[J].武汉植物学研究,2008,26（4）:337—342.[3]吴鹏程.苔藓植物生物学[M].北京：科学出版社，1998.[4]ZHONGZHP(钟珍萍),WUNH(吴乃虎).AreviewofthestructureandexpressionofplantphotogenepsbA[J].JournalofFujianAgriculturalUniversity(福建农业大学学报),1997,26(3):257-261(inChinese).[5]马建忠.叶绿体基因组的模式基因—光系统Ⅱ32kDa蛋白基因(psbA)的研究[J].生物技术通报，1993，（5）：22-23.[6]李晓鹏.PSⅡ反应中心D1蛋白的小肽抗体的制备和鉴定[J].生物化学与生物学进展,1997,（3）:283-285.[7]郭延平,刘辉,胡美君,等.植物PSⅡ反应中心D1蛋白的结构与功能[J].园艺学进展(第七辑),2006,326-331.[8]YANGZ.Computationalmolecularevolution[M].Oxford:OxfordUniversityPress,2006.[9]ThompsonJD,GibsonTJ,PlewniakF,JeanmouginF,HigginsDG.TheCLUSTAL_Xwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools.NucleicAcidsRes,1997,25(24):4876-4882.[10]DRUMMONDAJ,RAMBAUTA.BEAST:Bayesianevolutionaryanalysisbysamplingtrees[J].BMCEvol.Biol.,2007,7:214-221.[11]POSADAD,CRANDALLK.Modeltest:testingthemodelofDNAsubstitution[J].Bioinformatics,1998,14:817-818.[12]RAMBAUTA,DRUMMONDAJ.2009.Tracerv1.4.1http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/[2009-09-21].[13]YANGZ.PAML4:PhylogeneticAnalysisbyMaximumLikelihood[J].Mol.Biol.Evol.,2007,24:1586-1591.[14]NielsenR,YangZ.LikelihoodmodelsfordetectingpositivelyselectedaminoacidsitesandapplicationstotheHIV-1envelopegene.Genetics,1998,148(3):929-936.[15]YangZ.MaximumlikelihoodestimationonlargephylogeniesandanalysisofadaptiveevolutioninhumaninfluenzavirusA.JMolEvol,2000,51(5):423-432.[16]YangZ,NielsenR.Synonymousandnonsynonymousratevariationinnucleargenesofmammals.JMolEvol,1998,46(4):409-418.[17]YANGZ,WONGW,NIELSENR.Bayesempiricalbayesinferenceofaminoacidsitesunderpositiveselection[J].Mol.Biol.Evol.,2005,22:1107-1118.[18]ZHANGJ,NIELSENR,YANGZ.Evaluationofanimprovedbranch-sitelikelihoodmethodfordetectingpositiveselectionatthemolecularlevel[J].Mol.Biol.Evol.,2005,22:2472.[19]KOSAKOVSKYPONDSL,FROSTSDW.Notsodifferentafterall:acomparisonofmethodsfordetectingaminoacidsitesunderselection[J].Mol.Biol.Evol.,2005,22(5):1208-1222.[20]FaresMA,McNallyD.CAPS:coevolutionanalysisusingproteinsequences[J].Bioinformatics.2006,22(22):2821-2822.[21]ArnoldK.,BordoliL.,KoppJ.,andSchwedeT.(2006).TheSWISS-MODELWorkspace:Aweb-basedenvironmentforproteinstructurehomologymodelling.Bioinformatics,22,195-201.[22]SchwedeT,KoppJ,GuexN,andPeitschMC(2003)SWISS-MODEL:anautomatedproteinhomology-modelingserver.NucleicAcidsResearch31:3381-3385.[23]Guex,N.andPeitsch,M.C.(1997)SWISS-MODELandtheSwiss-PdbViewer:Anenvironmentforcomparativeproteinmodelling.Electrophoresis,18:2714-2723.[24]JörnHentschel,MatthewJ.vonKonrat,TamásPócs,AlfonsSchäfer-Verwimp,A.JonathanShaw,HaraldSchneider,JochenHeinrichs.MolecularinsightsintothephylogenyandsubgenericclassificationofFrullaniaRaddi(Frullaniaceae,Porellales)..MolecularPhylogeneticsandEvolution.2009，52:142-156.[25]Jochenheinrichsetal.Evolutionofl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