紫外分光光度法的应用

关于紫外分光光度法的应用第1页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三一、物质对光的选择性吸收●物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定。●人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：400~760nm。●让白光通过棱镜，能色散出红、橙、黄、绿、蓝、紫等各色光。●单色光：单一波长的光●复合光：由不同波长的光组合而成的光，如白光。●光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定比例混合得到白光，

称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。第2页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生。

即物质的颜色是它所吸收光的互补色。无色溶液：透过所有颜色的光有色溶液：透过光的颜色黑色：吸收所有颜色的光白色：反射所有颜色的光物质的本色第3页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三完全吸收完全透过吸收黄光光谱示意表观现象示意复合光蓝光无色黑色物质的颜色与光的关系第4页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三

基于物质吸收紫外或可见光引起分子中价电子跃迁、产生分子吸收光谱与物质组分之间的关系建立起来的分析方法，称为紫外可见分光光度法（UV-vis）。二、紫外-可见分光光度法（1）灵敏度高，可测到10-7g/ml。（2）准确度好，相对误差为1%-5%，满足微量组分测定要求。（3）选择性好，多种组分共存，无需分离直接测定某物质。（4）操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单、便宜。（5）应用广泛，无机、有机物均可测定。第5页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三紫外-可见分光光度法的基本原理一、透光率（透光度）和吸收度①透光率T定义：T取值为0.0%~100.0%T=0.0%：光全吸收T=100.0%：光全透过②吸光度（吸收度）AT=ItI0×100%显然，T↑，溶液吸收度↓；T↓，溶液吸收度↑。即透光率T反映溶液对光吸收程度，通常用1/T反映吸光度。定义：A=lg1T=-lgT=lgI0ItA=-lgT,T=10-AtI0=It+Ia+Ir吸收光反射光透过光Ia③T与A关系：IrA∝1/T，T=0，A=∞，T=100%，A=0第6页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三二、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1760年和1852年研究吸光度Ａ与溶液厚度Ｌ和其浓度Ｃ的定量关系：朗伯定律：A=k1×L比尔定律：A=k1×CA=kCL

一束平行单色光通过一均匀、非散射的吸光物质溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液温度等保持不变时，该溶液的吸光度A与其浓度C及液层厚度L的乘积成正比。①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。②均匀、无散射溶液、固体、气体。③吸光度A具有加和性。Aa+b+c=Aa+Ab+Ac

注意!适用范围朗伯-比尔定律:L→2L时，A、T→？

2AA=-lgT,T=10-A=10-kcL吸光系数浓度液层厚度T2第7页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三三、吸光系数1、摩尔吸光系数或Em：

在一定λ下，c=1mol/L，L=1cm时的吸光度。单位：L/(mol.cm)（1）一定条件下是一个特征常数。（2）在温度和波长等条件一定时，ε仅与物质本身的性质有关，与待测物浓度c和液层厚度L无关；（3）定性和定量分析依据：同一物质在不同波长时ε值不同。不同物质在同一波长时ε值不同。

εmax表明了该物质在最大吸收波长λmax处的最大吸光能力。

4、吸光系数的意义:2、百分吸光系数/比吸光系数：3、两者关系:A=kcLk=A/cL

一定λ下,c=1%(W/V)，L=1cm时的吸光度。单位：100ml/g.cm1g/100ml第8页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三1．定义：以A为纵坐标，λ为横坐标，绘制的λ~A曲线。四、吸收光谱（吸收曲线）2．吸收光谱术语：①吸收峰→λmax,②吸收谷→λmin③肩峰→λsh,④末端吸收⑤强带：

max>104，弱带：

max<103特征值第9页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三吸收光谱

特征值：

λmax

λmin

λsh

●同一物质的吸收光谱特征值相同,(每一波长处吸光系数相同)。同一物质相同浓度的吸收曲线重合。●同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似,λmax相同。（定量）●不同物质相同浓度，其吸收曲线形状,λmax不同。（定性）定性、定量分析：在吸收曲线λmax处测吸光度A。第10页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三吸收曲线的讨论：（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。（3）③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。（5）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。第11页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三五、偏离光的吸收定律原因朗伯-比尔定律：A=kCL依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线（一）化学因素（二）光学因素

偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面：第12页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三该定律适用于稀溶液，溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。尤其浓度过高(>0.01mol/L)会使C与A关系偏离定律：①粒子相互作用加强，吸光能力改变。②溶液对光的折射率显著改变。故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。

溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。

例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。（一）化学因素朗—比耳定律假定所有的吸光质点之间不发生相互作用；第13页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三（二）光学因素1．非单色光的影响：入射光为单色光是应用该定律的重要前提：2．杂散光的影响：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。3．反射和散色光的影响：散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形。

通常可用空白对比校正消除。4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形。第14页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三0.575紫外-可见分光光度计依据朗伯-比尔定律，测定待测液吸光度A的仪器。（选择不同波长单色光λ、浓度）光源单色器吸收池检测器信号处理及显示分光光度计外观分光光度原理图:第15页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三一、主要部件1.光源：2.单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件钨灯或卤钨灯氢灯或氘灯—可见光源350~1000nm—紫外光源200~360nm色散元件棱镜光栅对不同波长的光折射率不同衍射和干涉,不同波长的投射方向不同玻璃棱镜:适用于可见区石英棱镜:适用于紫外区高度抛光的玻璃上刻有等宽、等距平行条痕狭缝：进出光狭缝。准直镜：复合光→平行光→色散后→聚集狭缝最佳宽度:减小狭缝宽度而溶液吸光度不变。3.吸收池：比色皿、比色杯，装样品溶液。有玻璃、石英杯两种4.检测器：光→电，光电池(硒,硅)，光电管(红,紫)，光电倍增管。5.信号处理显示器：放大较弱的电信号，并在检流计上显示出来。第16页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三比色皿：玻璃VS石英杯适用的波长范围不一样石英的范围更广,波长最小可以到达210nm,可以用在紫外光程,一般测核酸和蛋白都用石英比色皿,基本上测什么试剂都可以,但价格高,一般一个都要在几百块人民币玻璃的局限性大一些,主要用于可见光程,相对便宜现在市场上塑料比色皿也在流行起来,但主要还是欧美地区使用的最多,特点是价格便宜,不怕摔,可以一次性试用,省时省力,也更安全,也分不同材质,但波长范围仍然还是比石英比色皿小一些光学玻璃适用透过率：320nm-2500nm紫外石英适用透过率：190nm-2500nm第17页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三二、分光光度计类型

单波长

分光光度计双波长

分光光度计单光束

分光光度计双光束

分光光度计可见光区:可紫外-见光区:721型751，754型760型仪器简单，单色光误差大仪器简单，要求光强度稳定高普遍采用的光路wfz800-S,日本岛津UV-300型特定情况（背景、共存组分干扰）下使用各种分光光度计使用《化学教学网》视频操作第18页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三第四节分析条件的选择一、测量条件的选择1.吸光度的范围：T∈20%~65%，A∈0.2～0.7之间吸收最大的波长为入射光，干扰最小二、显色反应条件的选择

显色反应：将试样组分转变成有较强吸收的有色化合物的反应。显色剂：与被测组分化合生成有色物质的试剂。1.显色反应的条件：(1)定量反应、选择性要好；干扰少。(2)灵敏度要高，摩尔吸光系数ε大。(3)有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定。(4)有色化合物与显色剂的最大吸收波长之差≥60nm。(5)显色反应的条件要易于控制。2.测定波长的选择：M十R＝MR

（被测物）（显色剂）（有色配合物）第19页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三三、参比溶液（空白溶液）的选择

用于调节100%T，若选择不适当，对测量读数的影响较大。主要是消除溶液中其他组分对光的吸收等带来的影响。1.溶剂参比液当试液、试剂、显色剂均无色时，用溶剂(通常是蒸馏水)作参比液；3.试剂参比液如果显色剂或其他试剂略有吸收，可用不含待测组分的试剂溶液作参比溶液。2.试样参比液如果试样中的其他组分也有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液。4.平等操作参比液用不含待测组分的溶液，在相同条件下与待测试样同时进行处理，此为平行操作参比溶液。第20页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三定性与定量分析紫外-可见分光光度法主要用于有机物分析。定性分析：比较吸收光谱特征可以对纯物质进行鉴定及杂质检查；定量分析：利用光吸收定律进行分析（一）定性鉴别：一、定性分析对比法：比较样品化合物的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征；或与文献所载的化合物的标准谱图进行核对。同一物质有相同吸收光谱图，反之不一定是同一物质。第21页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准品；下：样品第22页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三2、对比吸光度（或吸光系数）相同条件下，同一物质吸光度比值是吸光系数的比值。（二）纯度检查1、杂质检查：有杂质时，吸收光谱变形。2、杂质限量检查：①以某一波长吸光度值表示；②以峰谷吸光度比值表示。3、对比吸收光谱的一致性将试样与已知标准样品用同一溶剂配制成相同浓度的溶液，在同一条件下分别扫描吸收光谱，核对其一致性。1、对比吸收光谱特征数据：λmax、λmin、λsh①不同基团化合物可能有相同的λmax值，但εmax有明显差别；②有相同吸光基团同系物，其λmax、εmax值接近，但分子量不同，E1%1cm差别大。A1/A2=E1/E2第23页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三例1：阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收峰迁移到312nm，只要检测在312nm处是否有吸收峰，即可判断有无水杨酸。例2：无水乙醇精制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留苯，测定其吸收光谱，乙醇在210~600nm之间无吸收峰，而苯在250、254nm有吸收峰，以纯无水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在250、254nm处出现吸收峰，则说明有苯残留。例3：如药典规定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原标示浓度为0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确稀释20倍，水做参比，用361nm测定的吸光度为0.512，其含量为：1%∶207=x%∶0.512，x%=0.00247%，浓度=0.00247%×20=0.049%

第24页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三溶剂对紫外光谱的影响在测定有机物的紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内，应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收光谱的精细结构。

与标准样品或标准图谱进行对比时，必须用相同的溶剂。所选择的溶剂在所研究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂的吸收不可忽略。第25页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三常用溶剂的波长范围如下：.

溶剂使用波长范围溶剂使用波长范围甲醇>210二氯甲烷>235.

乙醇>215氯仿>245.

水>210乙酸乙酯>260.

96%硫酸>210苯>280.

乙醚>215甲苯>285.第26页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三二、定量分析分光光度法被广泛的应用在各个领域，环境、医药、石油等测定无机、有机微量成份。由于操作简单，仪器廉价，一般说是常用的首选方法。（一）单组分的定量分析1、标准曲线（工作曲线）法：配制一系列不同浓度的标准溶液，在同一条件下分别测定吸光度，然后以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制A-C关系曲线。●符合朗-伯定律，则得到一条通过原点的直线。●根据测得样品吸光度，从标准曲线中求得样品溶液浓度，最后计算含量。原理:根据朗伯-比尔定律，选择合适λ测A，求出浓度。第27页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三2、标准对照法

以该物质吸收光谱图中max为入射光，配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cS，测其AS，再将样品溶液推入光路，测其AX，则试样溶液的浓度cX为：例：VB12含量测定：精确吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀释n倍，使其浓度约为30μg/ml，另外配VB12标准液浓度为30μg/ml，蒸馏水调零，用361nm测定吸光度A，计算：测定液中VB12含量（μg/ml）=（A样品/A标准品）×30；注射液中VB12含量（μg/ml）=（A样品/A标准品）×30×n（稀释倍数）÷V（取样量,ml）第28页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三（二）多组分的定量分析法

在含有多种组分的溶液中，如果要测定多个组分，可以根据情况的不同，采用不同的方法来进行测定。测量依据——吸光度的加和性：(1)(2)(3)第29页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三(1)图计算法----两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）

a图中，a,b组份最大吸收波长λmax不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。(2)图计算法---两组分吸收光谱部分重叠①a、b两组分的吸收光谱部分重叠，此时λ1处按单组分测定a组分浓度，b组分此处无干扰。②在λ2处测得混合溶液的总吸光度A2a+b,根据加和性计算cb，假设液层厚度为1cm,则：A2a+b=A2a+A2b=E2a·ca+E2b·cb第30页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三例：四环素和金霉素混合物的测定：四环素在0.25MNaOH中最大吸收峰为380nm，E1%1cm，λmax=372.0；在0.1MHCl中最大吸收峰为355nm，E1%1cm，λmax=303.2；两吸收峰都可以做为四环素的测定波长。但与金霉素共存时，因为金霉素在355nm处有吸收（金霉素在0.1NHCl中E1%1cm，λmax=182.6），只能用380nm测定四环素。混合样品在355nm处测定二者的总吸光度,在380nm处测得四环素的吸光度，则两者的浓度都可以求出。测定方法：(1)测定1%混合物在0.1MHCl溶液的吸光度A335(2)测定1%混合物在0.25MNaOH溶液的吸光度A380

计算：四环素浓度C1（g%）=[AC1，380/E1%（C1）1cm，380]=AC1，380/372.0金霉素浓度C2（g%）=[AC1+C2335－（E1%（C1）1cm，355×C1）]÷E1%（C2）1cm，355=[AC1+C2335－（303.2×AC1，380÷372.0）]÷182.6第31页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三(3)图计算法----两组分吸收光谱完全重叠--混合样品测定

(3)图中，a,b吸收光谱双向重迭，互相干扰，在最大波长处互相吸收。处理方法如下：1.解线性方程组法过程：第32页，讲稿共39页，2023年5月2日，星期三2.等吸收双波长法-注：须满足两个基本条件选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大第