细胞融合-与-单克隆抗体

细胞融合与单克隆抗体(kàngtǐ)CellFusionandMonoclonalAntibodies第一页，共六十二页。精选ppt4.1细胞融合4.2杂种细胞的遗传特性(tèxìng)和应用4.3淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术第二页，共六十二页。精选ppt4.1细胞融合4.11聚乙二醇介导的细胞融合4.12细胞电融合4.13杂种(zázhǒng)细胞的筛选第三页，共六十二页。精选ppt4.1细胞融合定义：指用自然或人工方法、使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程，又称为(chēnɡwéi)体细胞杂交第四页，共六十二页。精选ppt4.11聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合

原理：PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调(shītiáo)并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。第五页，共六十二页。精选ppt影响(yǐngxiǎng)因素：

分子量：400—6000（通常：1000—4000）浓度：20—60%（通常：30—50%）时间：悬浮法1—2min

离心法5—8minpH：偏碱为宜（pH7.4—8.0）其他：二甲(èrjiǎ)亚砜、植物血凝素第六页，共六十二页。精选ppt4.12细胞(xìbāo)电融合原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1—100MHz和100—1000V/cm的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向发生(fāshēng)双向电泳，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解，从而触发细胞融合。第七页，共六十二页。精选ppt双向电泳：在交流电场的作用下（1MHz，150V/cm）细胞(xìbāo)膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞(xìbāo)会发生相互的紧密接触。第八页，共六十二页。精选ppt可逆电降解(jiànɡjiě)：在高频电场的脉冲作用下（50ms，电场强度1.2－2kV/cm），细胞膜上的离子发生位移，而使电荷分开，细胞质膜产生电势，正、负电荷相互吸引，细胞膜变薄，随细胞势的增加，膜降解穿孔，形成微孔。电场诱发的微孔面积和数目与细胞膜总表面积相对不大时，微孔可以重新封闭。第九页，共六十二页。精选ppt电场(diànchǎng)示意图第十页，共六十二页。精选ppt甜菜(tiáncài)原生质体电融合过程1）在高频电流电场下的相互接触(jiēchù)。2）脉冲刺激后30s3)50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。第十一页，共六十二页。精选ppt注意事项1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用(xuǎnyòng)适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。第十二页，共六十二页。精选ppt优点(yōudiǎn)：融合(rónghé)率高，达70％－80％，甚至100％融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞第十三页，共六十二页。精选ppt4.13杂种细胞(xìbāo)的筛选原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能(kěnéng)有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。1）亲本2）同核体：同源原生质体的融合体3）异核体：非同源的原生质体的融合体4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体第十四页，共六十二页。精选ppt植物(zhíwù)细胞筛选方式1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色(lǜsè)，并能成长第十五页，共六十二页。精选ppt2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异(chāyì)选择杂种细胞。如：亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡第十六页，共六十二页。精选ppt3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体亲本2：叶肉细胞原生质体在荧光显微镜下，亲本1为红色(hóngsè)，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分第十七页，共六十二页。精选ppt4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以(kěyǐ)产生内源激素，在培养基上不需加激素。第十八页，共六十二页。精选ppt动物细胞的筛选(shāixuǎn)方式：1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有(hányǒu)两种抗生素的培养基上生长第十九页，共六十二页。精选ppt2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长(shēngzhǎng)繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。第二十页，共六十二页。精选ppt3）温度敏感(mǐngǎn)突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。第二十一页，共六十二页。精选ppt4.2杂种细胞的遗传特性和应用(yìngyòng)4.21杂种细胞在细胞生物学研究中的应用4.23杂种细胞在植物育种中的应用第二十二页，共六十二页。精选ppt4.21杂种(zázhǒng)细胞在细胞生物学研究中的应用1）基因定位不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即染色体分离的现象。由此，可根据表型和与表型特征(tèzhēng)相对应的基因在特定染色体上。例如：HGPRT－人细胞与TK－的小鼠细胞融合后，可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E组染色体的杂种细胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E组染色体上的。第二十三页，共六十二页。精选ppt2）体细胞杂种的致瘤性分析通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。3）遗传缺陷的基因互补基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。通过这种基因互补，可以用正常基因来治疗由于(yóuyú)基因突变或基因缺失的疾病。第二十四页，共六十二页。精选ppt4）分化功能表达(biǎodá)调控的研究通过细胞融合可将不同分化状态或组织类型的细胞构建成为能够存活的种内或种间杂种，同时对杂种细胞内的基因组和胞质观察和分析，了解如何通过相互作用而最终导致原先表达的分化性状熄灭或保留。第二十五页，共六十二页。精选ppt4.22杂种(zázhǒng)细胞在植物育种中的应用杂种细胞是一条新的育种途径，可以产生新经济性状的良种。科学家已经在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了杂种再生植株。一些近亲(jìnqīn)植物、有性不亲和的组合，如马铃薯×番茄等都得到了再生植株。目标：地上和地下部兼用种、固氮禾等具有两种不同优势性状的新品种。第二十六页，共六十二页。精选ppt4.3单克隆抗体4.31抗体的结构与功能4.32单克隆抗体的制备(zhìbèi)和生产4.34单克隆抗体的改造和应用第二十七页，共六十二页。精选ppt4.31抗体的结构(jiégòu)与功能第二十八页，共六十二页。精选ppt第二十九页，共六十二页。精选ppt抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。抗体分子：由四条肽链所组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）。结合区：抗体分子上有两个(liǎnɡɡè)抗原结合区可变区（V区）稳定区（C区）第三十页，共六十二页。精选ppt人体内的五种(wǔzhǒnɡ)抗体第三十一页，共六十二页。精选ppt4.32单克隆抗体(kàngtǐ)的制备单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对(zhēnduì)某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。第三十二页，共六十二页。精选ppt单抗的制备(zhìbèi)过程动物免疫与亲本细胞的选择细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选：有限稀释(xīshì)法等单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的纯化第三十三页，共六十二页。精选ppt亲本(qīnběn)细胞的选择骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续(liánxù)继代培养，且为HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。第三十四页，共六十二页。精选ppt淋巴细胞：经过(jīngguò)免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：体内法或体外法。体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。

第三十五页，共六十二页。精选ppt细胞融合将免疫脾细胞(xìbāo)和小鼠骨髓细胞(xìbāo)以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7—10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。第三十六页，共六十二页。精选pptHAT培养基筛选(shāixuǎn)杂交瘤细胞细胞团块分散后，加HAT溶液(róngyè)，稀释至骨髓瘤细胞不超过2×105ml，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。用HAT选择性培养时每隔2－3天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。第三十七页，共六十二页。精选ppt细胞融合的选择(xuǎnzé)示意图第三十八页，共六十二页。精选pptHAT选择(xuǎnzé)系统HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分(chéngfèn)与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种。第三十九页，共六十二页。精选ppt杂交瘤技术中，常选用(xuǎnyòng)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；TK-

细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。第四十页，共六十二页。精选ppt嘌呤(piàolìng)合成通路的阻断第四十一页，共六十二页。精选ppt淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。杂种细胞通过(tōngguò)互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT-

或TK-

亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。第四十二页，共六十二页。精选ppt特异性杂交瘤细胞(xìbāo)的筛选通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测定。细胞抗原可采用免疫荧光、51Cr释放(shìfàng)试验、溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等方法直接测定针对这些抗原的抗体。第四十三页，共六十二页。精选ppt利用培养基对单抗进行(jìnxíng)鉴定的过程第四十四页，共六十二页。精选ppt杂交瘤细胞(xìbāo)的克隆化培养利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。方法有有限稀释法、软琼脂(qióngzhī)培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。第四十五页，共六十二页。精选ppt有限(yǒuxiàn)稀释法通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1）取出阳性孔内的细胞进行计数2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞。4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察(guānchá)到有集落生长的孔。5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。第四十六页，共六十二页。精选ppt软琼脂(qióngzhī)培养法在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固(nínggù)后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。第四十七页，共六十二页。精选ppt单抗的大规模生产(shēngchǎn)1）诱生腹水将稳定分泌(fēnmì)单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3~5×106

杂交瘤细胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含1~10mg单抗。2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。第四十八页，共六十二页。精选ppt4.33

单克隆抗体(kàngtǐ)的改造和应用单抗作为体内体外诊断试剂在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等单克隆抗体靶向制剂，治疗癌症等疾病(jíbìng)杂交人－鼠单克隆抗体第四十九页，共六十二页。精选ppt单抗作为体内体外诊断(zhěnduàn)试剂现在已经有各种不同类型的单抗试剂合在市场出售，例如乙型肝炎的表面抗原，铁蛋白、促绒毛膜性激素、促甲状腺激素、癌症、艾滋病等诊断(zhěnduàn)试剂。用同位素标记的单抗在特定的组织中成象的技术可以用于肿瘤、心血管畸形的体内诊断。第五十页，共六十二页。精选ppt1、单克隆抗体(kàngtǐ)靶向制剂1）药物与单抗直接偶联通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基(suōjī)之间直接形成稳定的酰胺键。利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱，最后还原。这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一定的选择性。如：1，4－溴柔红霉素与肿瘤细胞单抗形成的偶合物，对肿瘤有明显的选择性毒性。第五十一页，共六十二页。精选ppt2）药物通过小分子与单抗连接通过一些小分子交联剂，把药物分子上的某些基团连接起来。小分子交联剂：如同型双功能试剂，包括戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐；异型双功能试剂：N－琥珀酰胺基－3－丙酸和寡肽等。顺乌头酸酐制成的最常用，在中性条件下较稳定，在酸性条件下容易(róngyì)发生水解。这种靶向试剂与肿瘤的表面抗原结合后，会进入溶酶体，在酸性环境下释放药物，而杀死肿瘤细胞。第五十二页，共六十二页。精选ppt3）药物通过大分子与抗体相连(xiānɡlián)大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。总之，利用单抗试剂合可以作为靶向药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、各种病原体病等。第五十三页，共六十二页。精选ppt2、杂交(zájiāo)人－鼠单克隆抗体鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统(xìtǒng)，还可能引发人对鼠源抗体本身的免疫反应。在抗体中，Fc片段在抗体中的作用是激活机体免疫反应。对鼠源抗体进行改造，利用人源的Fc区域的DNA片段替换鼠源单抗的Fc的DNA片段。嵌合抗体可以保留其目标专一性，降低人的抗鼠反应。第五十四页，共六十二页。精选ppt一种制备人肿瘤(zhǒngliú)单克隆抗体的方案第五十五页，共六十二页。精选ppt3、人源单克隆抗体(kàngtǐ)方法1：分离人B细胞，使之与荧光标记的抗原(kàngyuán)相结合，通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B细胞，并用Epstein－Barr病毒转化，得到少量的单抗。方法2：将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内，遇到抗原时，产生人源的抗体。方法3：将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎中，能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠第五十六页，共六十二页。精选ppt4、抗体(kàngtǐ)融合蛋白将抗体的可变区与一非抗体蛋白融合起来，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。可以保留不同程度的抗体结合特异性和激发其他免疫(miǎnyì)反应的能力。第五十七页，共六十二页。精选ppt5、