细胞培养常用技术

细胞培养常用(chánɡyònɡ)技术第一页，共一百一十七页。精选pptCell第一类研究方法形态观察(guānchá)技术第二类研究方法生物化学分析(huàxuéfēnxī)技术第三类研究(yánjiū)方法V细胞生理学技术第四类研究方法其它实验技术第二页，共一百一十七页。精选ppt第一节细胞形态结构(jiégòu)观察技术目镜物镜集光器载物台光源1.普通(pǔtōng)光镜的结构:（一）普通(pǔtōng)光学显微镜一、光学显微镜第三页，共一百一十七页。精选ppt第四页，共一百一十七页。精选ppt2.普通(pǔtōng)光镜的成像原理2图像样品光线聚光器物镜光学显微镜的光路图第五页，共一百一十七页。精选ppt分辨率分辨率指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常是用相邻两点间的距离来表示.与数值孔径的关系：D=0.61λ/NA=0.61λ/N·sin(α/2)D为分辨率;λ为光波波长;要提高分辨率，可采取使用短波长光源、采用介质(jièzhì)折射率高的袖浸系、增大孔径角以提高NA值等措施。第六页，共一百一十七页。精选ppt倒置显微镜第七页，共一百一十七页。精选ppt生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生(chǎnshēng)圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。显微镜观察(guānchá)细胞(xìbāo)的生长状态第八页，共一百一十七页。精选pptBMSCs第九页，共一百一十七页。精选ppt培养细胞的生长(shēngzhǎng)过程第十页，共一百一十七页。精选pptAnip973第十一页，共一百一十七页。精选ppt在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状，不易(bùyì)看清。往往将标本切片进行(jìnxíng)染色——提高可辨程度。移动臂蜡或树脂包埋的样品切片用钢刀样品切片蜡带伸展在盖玻片和载玻片之间的切片切片机第十二页，共一百一十七页。精选ppt染色的原理未染色(rǎnsè)已染色(rǎnsè)第十三页，共一百一十七页。精选ppt(二)暗视野显微镜这种显微镜使照明光线不能直接(zhíjiē)进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。中央(zhōngyāng)遮光板第十四页，共一百一十七页。精选ppt暗视野聚光器的设计原理视野的背景(bèijǐng)黑物体的边缘亮第十五页，共一百一十七页。精选ppt利用这种显微镜能见到小至5nm的质点，分辨率比普通(pǔtōng)显微镜高了40倍，有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。第十六页，共一百一十七页。精选ppt(三)相差(xiānɡchà)显微镜由荷兰物理学家F.Zernike(1932)发明：提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察(guānchá)的难题。获诺贝尔物理奖(1953)(phasecontrastmicroscope)光通过不同密度物质时滞留的时间不同，利用相差板，将厚度(hòudù)的差别转化成明暗的差别，增加反差。第十七页，共一百一十七页。精选ppt特点：在聚光器或光源上加了一环形(huánxínɡ)光阑(annulardiaphragm),在物镜中加了一环形相板(annularphaseplate)。相差(xiānɡchà)显微镜的构造:上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度（或高度）恰好(qiàhǎo)可使通过此区的光线提前或延后1/4λ光程差。环形光阑环形相板使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。第十八页，共一百一十七页。精选ppt相差(xiānɡchà)显微镜的构造第十九页，共一百一十七页。精选ppt相差(xiānɡchà)显微镜的光路图解根据设计，只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其他部分通过。两组光线和轴后发生(fāshēng)干涉现象。第二十页，共一百一十七页。精选ppt两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差(fǎnchā)（正反差）——结构比周围介质更加变暗。未透过(tòuɡuò)标本的直射光（通过相板环形区）与透过标本的偏折光（由相板其他部分通过）和轴后发生干涉：S-DSD如果(rúguǒ)为凹形相板：通过样品的光线延后1/4λ-1/4λ-1/4λ第二十一页，共一百一十七页。精选ppt则两组光波相加，振幅加大，形成亮反差（负反差）——标本(biāoběn)结构比周围介质更加变亮。S+DSD如果(rúguǒ)为凸性相板：由于标本的各种结构的厚度和折射系数(xìshù)不同，在相差显微镜下显示出不同的明暗度。-1/4λ+1/4λ第二十二页，共一百一十七页。精选ppt显微镜观察(guānchá)

相差显微镜（phasecontrastmicroscope）活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。

20世纪30年代荷兰Zernike

原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构(jiégòu)之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构(jiégòu)变得清晰。

第二十三页，共一百一十七页。精选ppt相差显微镜观察(guānchá)活细胞的步骤如下：调整(tiáozhěng)好相差显微镜

观察(guānchá)瓶皿准备调光调焦与摄影细胞观察第二十四页，共一百一十七页。精选ppt第二十五页，共一百一十七页。精选ppt(四)微分(wēifēn)干涉差显微镜Nomarski(1952)在相差(xiānɡchà)显微镜原理的基础上发明的：又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)与相差显微镜相比，其标本(biāoběn)可略厚一点，折射率差别更大。第二十六页，共一百一十七页。精选pptDIC显微镜首先DIC利用的是偏振光。此外，除了物镜外，还增加(zēngjiā)了四个光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程(shēnɡwùɡōnɡchénɡ)的显微操作常在这种显微镜下进行。第二十七页，共一百一十七页。精选pptDIC显微镜暗视野显微镜相差显微镜普通显微镜第二十八页，共一百一十七页。精选ppt荧光(yíngguāng)显微镜的成象原理(五)荧光(yíngguāng)显微镜第二十九页，共一百一十七页。精选ppt分裂细胞的免疫荧光图像(túxiànɡ)不同(bùtónɡ)荧光染料标记(biāojì)抗体特异性结合免疫荧光技术抗原(细胞的蛋白质成分)第三十页，共一百一十七页。精选ppt用荧光素标记抗体所显示出的细胞中蛋白质的分布(fēnbù)状态MPM-2DAPIMergedInterProMetaAnteTelo第三十一页，共一百一十七页。精选ppt(六)激光(jīguāng)共聚焦显微镜(LaserConfocalMicroscope,LCM)光源(guāngyuán)：通过共聚焦可进行光学切片对固相、液相物体(wùtǐ)均可进行观察特点：激光Q550MW型LCM第三十二页，共一百一十七页。精选ppt二.主要电镜制作(zhìzuò)技术三.扫描(sǎomiáo)隧道显微镜一.电镜基本知识二、电子显微镜电镜问世(wènshì)的必然性第三十三页，共一百一十七页。精选ppt光学(guāngxué)显微镜→0.2μm电子显微镜→0.2nm透射(tòushè)电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）第三十四页，共一百一十七页。精选ppt电子显微镜与光镜的主要(zhǔyào)区别电镜光镜电子束可见光电磁透镜玻璃透镜电磁聚焦机械聚焦超薄切片(0.05m)石蜡切片(1~10m)光源透镜聚焦方式切片厚度图像彩色图像黑白图像第三十五页，共一百一十七页。精选ppt0.61λ

D=——————N·Sinα/2λ：波长(bōcháng)

N：介质(jièzhì)折射率

α：物镜镜口角（标本(biāoběn)在光轴的一点对物镜镜口的张角）通常α最大值可达140°，空气中N=1，最短的可见光波长λ=450nm，因此，普通光镜的最大分辨率是0.2µm。肉眼的分辨率为0.2mm，因此，光学显微镜的最大的放大倍数为1000。放大倍数=显微镜的分辨率人肉眼的分辨率分辨力(resolution)是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常是用相邻两点间的距离来表示，可通过公式换算出：一、电镜基本知识：第三十六页，共一百一十七页。精选ppt各种(ɡèzhǒnɡ)光及电子束的波长第三十七页，共一百一十七页。精选pptRuska(1933~1938)便选择了电子束为光源来突破光学(guāngxué)显微镜分辨率的极限，发明了透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，其波长与发射(fāshè)电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。V1λµ第三十八页，共一百一十七页。精选ppt透射(tòushè)式电子显微镜(TEM)第三十九页，共一百一十七页。精选ppt中幼红细胞透射电镜血小板纵切面透射电镜第四十页，共一百一十七页。精选ppt由于(yóuyú)电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。1.

超薄切片(qiēpiàn)技术二、主要电镜制作(zhìzuò)技术：超薄切片铜网第四十一页，共一百一十七页。精选ppt以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大(zēnɡdà)黑白反差。第四十二页，共一百一十七页。精选ppt用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果(xiàoguǒ)，分辨力可达1.5nm左右。示肌动蛋白纤维

2.负染色(rǎnsè)技术第四十三页，共一百一十七页。精选ppt亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料(zīliào)即是利用这种方法取得的。冰冻(bīngdòng)断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。(freeze-etching)3.冰冻蚀刻技术(jìshù)第四十四页，共一百一十七页。精选ppt①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。②然后用冷刀骤然(zhòurán)将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构——蚀刻(etching)。蚀刻断裂冰冻蚀刻技术(jìshù)的操作步骤:第四十五页，共一百一十七页。精选ppt③蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后(ránhòu)将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。复膜④复膜显示(xiǎnshì)出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。第四十六页，共一百一十七页。精选ppt细胞冰冻(bīngdòng)断裂后的电镜图像第四十七页，共一百一十七页。精选ppt电子枪发射出的电子束作为“探针”，在样品表面进行扫描，电子束激发样品表面放出次级电子，次级电子的多少(duōshǎo)与样品表面的结构有关，被电荷的栅极收集后，即向电子显象管发送信号，在荧光屏上相应位置显示出明、暗差别。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。用来观察标本的表面(biǎomiàn)形态结构。(scanningelectronmicroscope,SEM)4.

扫描电镜技术(jìshù)第四十八页，共一百一十七页。精选ppt当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化，即可显示(xiǎnshì)出原子水平的凹凸形形态。探针物质第四十九页，共一百一十七页。精选ppt扫描式电子显微镜第五十页，共一百一十七页。精选ppt扫描式电子显微镜第五十一页，共一百一十七页。精选ppt耳听毛的扫描电镜图像(túxiànɡ)第五十二页，共一百一十七页。精选ppt第五十三页，共一百一十七页。精选ppt第五十四页，共一百一十七页。精选ppt其关键部件是有一个加上一定(yīdìng)电压的精密探针，当探针接近物质时，由于‘隧道效应’而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。1981年，Binnig、Rohrer等发明(fāmíng)：荣获(rónɡhuò)1986年诺贝尔奖！据量子力学中隧道效应设计，用来显示晶体表面原子布阵(scanningtunnelingmicroscope,STM)—+—+<100nm三、扫描隧道显微镜：第五十五页，共一百一十七页。精选ppt分辨率：X-Y向0.1nm（原子级分辨率）第五十六页，共一百一十七页。精选ppt扫描隧道显微镜能直接观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵，也能观察一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列,而不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤——纳米科学(kēxué)水平。扫描(sǎomiáo)隧道显微镜的优越之处：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。第五十七页，共一百一十七页。精选ppt细胞常用的观察(guānchá)及染色方法第五十八页，共一百一十七页。精选ppt活细胞的观察(guānchá)检测方法暗视野显微镜技术观察活细胞缩时显微镜摄影(shèyǐng)观察体外活细胞染色观察第五十九页，共一百一十七页。精选ppt暗视野显微镜技术观察活细胞（darkfieldmicroscope)原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。缩时显微摄影术观察（time-lapsecinemicrophotagraphy，TLCM）优点：可直接(zhíjiē)记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。缺点：较昂贵第六十页，共一百一十七页。精选ppt体外活细胞(xìbāo)染色观察体外活细胞染色(rǎnsè)就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色(rǎnsè)，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色(rǎnsè)观察，经染色(rǎnsè)的培养物还可以继续进行培养。碱性染料(rǎnliào)酸性染料（台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）活体染料噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胺蓝）恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油紫）丫嗪类（中性红、詹纳斯绿）三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）第六十一页，共一百一十七页。精选ppt中性(zhōngxìng)红染色

常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。结晶紫染色使用浓度为0.1％，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。台盼蓝染色用0.5％浓度的台盼蓝（trypanblue)，用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。第六十二页，共一百一十七页。精选pptE.coli以结晶(jiéjīng)紫(crystalviolet)染色第六十三页，共一百一十七页。精选pptB.cereus以石炭酸复红(carbolfuchsin)染色(rǎnsè)第六十四页，共一百一十七页。精选pptaureus以甲烯蓝(methyleneblue)染色(rǎnsè)第六十五页，共一百一十七页。精选ppt二、培养(péiyǎng)细胞常用的染色方法细胞固定的基本方法细胞常用(chánɡyònɡ)的染色方法细胞特殊的染色方法第六十六页，共一百一十七页。精选ppt1、细胞固定的基本(jīběn)方法固定组织、细胞的目的：把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等；同时，固定还可以使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。固定组织、细胞的原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求(yāoqiú)选择固定剂和固定方法。第六十七页，共一百一十七页。精选ppt固定前的准备：

各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。

悬浮细胞：离心(líxīn)（800～1000r/min）→PBS/Hanks漂洗2～3次

贴壁细胞：用镊子轻轻取出盖片→PBS/Hanks漂洗2～3次注：漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。第六十八页，共一百一十七页。精选ppt常用(chánɡyònɡ)固定液简单固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等混合固定液：甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4％多聚甲醛-PBS固定液等甲醇/醋酸固定液：甲醇：冰醋酸为3：1，现用现配，适用于Giemsa染色。FAA固定液：90mL80％酒精＋5mL冰乙酸＋5mL40％甲醛，适用于盖片单层培养的细胞，固定效果(xiàoguǒ)好。Carnoy固定液：较好的非水溶性固定液，60mL纯酒精＋30mL氯仿＋10mL冰乙酸，适用于显示细胞化学成分。第六十九页，共一百一十七页。精选ppt2、细胞(xìbāo)常用的染色方法H.E（苏木精-伊红）染色法原理：碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应(fǎnyìng)，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞的图像，并能提供良好的核浆对比染色。染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。第七十页，共一百一十七页。精选ppt细胞(xìbāo)涂片或细胞(xìbāo)甩片的HE染色细胞涂片或细胞甩片的制备：对于贴壁细胞，可将盖玻片放于培养器皿中，让培养细胞长于玻片上，然后用药物诱导细胞凋亡后取出，用4%多聚甲醛固定5min。对于悬浮细胞，用药物诱导细胞凋亡后，离心(líxīn)1000r/min收集细胞，用PBS洗2次，收集调整细胞数为1X105/ml，涂片或用离心甩片，用4%多聚甲醛固定5min；苏木素染色5min，用流水冲洗；盐酸乙醇分化30秒；自来水浸泡15min；伊红染色2min脱水，透明及封片按以下步骤：95%乙醇（I）1min，95%乙醇（II）1min，100%乙醇（I）1min，100%乙醇（II）1min，二甲苯石碳酸（3∶1）1min，二甲苯（I）1min，二甲苯（II）1min，中性树胶封片；第七十一页，共一百一十七页。精选ppt第七十二页，共一百一十七页。精选pptGiemsa（吉姆萨）染色法母液配制：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余甘油混在一起，56℃保温2h后，加入33mL纯甲醇，混匀，即为Giemsa母液，保存于棕色瓶内。染液配制：取9份pH6.8~7.38的Sorensen缓冲液和1份Giemsa母液混合即可。染色步骤：细胞标本用甲醇/醋酸固定液固定30min后，用滴管把染液布满玻片上，染色10~15min，用自来水冲去多余染液，空气干燥，二甲苯同名，光学树脂封固。染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。注意事项：染液宜现配现用，保存时间最好不用超过(chāoguò)48h，Giemsa对pH极敏感，缓冲液pH要调准确。第七十三页，共一百一十七页。精选ppt第七十四页，共一百一十七页。精选ppt第七十五页，共一百一十七页。精选ppt瑞氏染色(rǎnsè)观察【材料与试剂】Wright染液：称取Wright粉剂0.1g在碾钵内，充分碾磨，量取甲醇60ml，逐步加入，边加边碾磨，直到染料全部溶解，置试剂瓶中密封，1周后可用。Wright磷酸盐缓冲稀释液：Wright染液10ml，磷酸盐缓冲液20ml。磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾6.63g，磷酸氢二钠2.56g，蒸馏水1000ml。染色缸，离心涂片机，离心机，显微镜。其它：甲醇，0.08%醋酸(cùsuān)，中性树胶。【操作方法】收集细胞（1×106），PBS洗1次；将以上细胞涂片或用离心甩片机制成细胞甩片；用甲醇固定3～5min；将标本玻片插入Wright染液缸中染色2min；再插入Wright磷酸缓冲稀释液染色4～10min，用蒸馏水冲洗。如果颜色太深，可用0.08%醋酸分化数秒钟；晾干，用中性树胶封片；【结果判断】

正常细胞核染成深蓝色或蓝紫色，色泽均一，第七十六页，共一百一十七页。精选ppt3、细胞(xìbāo)特殊的染色方法Feulgen染色法Coomassie染色法PAS反应(fǎnyìng)法油红O（oilredO）法免疫荧光染色法免疫酶染色法第七十七页，共一百一十七页。精选pptFeulgen（福尔根）染色法原理：在60℃条件下，DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/L盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff）试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中，RNA不受影响，故染色具DNA特异性。准确的温度(wēndù)和盐酸浓度，适宜的水温、时间是成功的关键。水温过度或不足均降低染色强度。

此法能对DNA进行特异性染色试剂配制：1mol/LHCL：浓HCL8.5ml＋蒸馏水91.5mlSchiff试剂：母液装入棕色瓶，盖紧，黑纸包裹置于暗处

染色过程：选用Carnoy固定液染色结果：细胞核染成粉红色至紫红色，胞质为无色。第七十八页，共一百一十七页。精选ppt第七十九页，共一百一十七页。精选ppt考马斯亮蓝（Coomassie，BB）染色法原理：显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法试剂配制：固定液：0.1mol/LNaH2PO4·2H2O14.0mL＋0.1mol/LNa2HPO4·12H2O36.0mL＋蒸馏水50.9mL＋25％戊二醛50.0mL染色液：甲醇46.5mL＋冰醋酸7.0mL＋考马斯亮蓝0.02g染色过程(guòchéng)：染色结构：细胞内的微丝呈现蓝色。第八十页，共一百一十七页。精选ppt第八十一页，共一百一十七页。精选ppt过碘酸席夫反应(fǎnyìng)法

（periodicacidSchiffreaction，PAS）

原理：过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成两个游离的醛基，它们与Schiff试剂反应生成紫红色产物。

细胞内糖类的染色方法(fāngfǎ)试剂配制：染色过程：染色结果：细胞含糖原区呈紫红色。第八十二页，共一百一十七页。精选ppt第八十三页，共一百一十七页。精选ppt细胞内脂类的染色(rǎnsè)方法苏丹(sūdān)（Sudan）Ⅲ/Ⅳ法苏丹黑法Lillie油红O（oilredO）法Cain硫酸尼罗蓝（Nile）法锇酸（osmicacid）法第八十四页，共一百一十七页。精选ppt第八十五页，共一百一十七页。精选ppt第八十六页，共一百一十七页。精选ppt油红O（oilredO）法优点：油红O染色的脂肪比苏丹Ⅲ法染的颜色要深，对微小的脂滴易于显示(xiǎnshì)，而且沉淀较少。

10％中性甲醛溶液的配制﹙pH7.0﹚：量取37％~40％甲醛20mL，蒸馏水180mL，加入0.8g磷酸二氢钠﹙NaH2PO4·H2O﹚、1.3g磷酸氢二钠﹙Na2HPO4﹚，配制成200mL10％中性甲醛溶液，密封备用。第八十七页，共一百一十七页。精选ppt第八十八页，共一百一十七页。精选ppt一．免疫荧光细胞(xìbāo)化学技术

免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微显示的精确性相结合。用已知的抗体在不影响其免疫学特性的前提下与荧光素相结合。然后将结合了荧光素标记的抗体作为一种标准试剂。对被检细胞进行检测和鉴定(jiàndìng)。并在荧光显微镜下采用一定波长的荧光，可以直接观察被检测中有否特异荧光的表达。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）及藻红蛋白（PE）在流式细胞术（FCM）中较常用。较为经典的方法有下列几种：第八十九页，共一百一十七页。精选ppt（一）直接法是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。依据荧光出现(chūxiàn)的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制备大量特异性的荧光抗体。（二）间接法间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素标记抗抗体使之形成被检抗原－抗体－荧光素标记抗抗体复合物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光标志物，所以其敏感性比直接法要高。第九十页，共一百一十七页。精选ppt组织(zǔzhī)切片组织(zǔzhī)切片直接(zhíjiē)法间接法Ab1-荧光Ab1Ab2-荧光免疫荧光法原理图第九十一页，共一百一十七页。精选ppt（三）补体法这是一种(yīzhǒnɡ)间接法的改良。既在抗原抗体反应时加入补体，然后再与荧光素标记的抗补体抗体结合形成抗原－抗体－抗补体荧光抗体复合物。此法敏感性较高。但其较易出现非特异性染色，而且操作过程相对较复杂。（四）双标记法运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特点，将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体。可在同一标本上测定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用间接法进行。若分别采用兔源性和鼠源性等不同种属的抗体，甚至可进行三重或多重标记法。第九十二页，共一百一十七页。精选ppt加入3%多聚甲醛固定(gùdìng)细胞，固定(gùdìng)30min后弃去。PBS洗涤3次，每次5min。加5%Tritoon-X100室温温和震荡15min，PBS洗涤3次，每次5min。室温下，加1%山羊血清封闭1h，同时在水平摇床温和振荡孵育。以1：200比例加入一抗，室温下振荡孵育1h，PBST洗涤3次，每次5min。以1：200比例加入FITC标记的羊抗鼠二抗，室温下振荡孵育1h，PBST洗涤3次，每次5min。最后加入DAPI(1：1000)进行核染色5min，PBS洗涤1次，立即到荧光显微镜下观察。第九十三页，共一百一十七页。精选ppt第九十四页，共一百一十七页。精选ppt单色荧光(yíngguāng)染色第九十五页，共一百一十七页。精选ppt双色荧光(yíngguāng)染色第九十六页，共一百一十七页。精选ppt多色荧光(yíngguāng)染色第九十七页，共一百一十七页。精选ppt第九十八页，共一百一十七页。精选ppt二、免疫酶细胞(xìbāo)化学技术

免疫酶细胞化学技术是将抗原－抗体反应的特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。选用的标记酶有辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、β－D半乳糖苷酶（β－D－Gal）等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定且部分已制成试剂盒出售(chūshòu)。目前已广泛地被临床和实验室所应用第九十九页，共一百一十七页。精选ppt

细胞二步酶标法三步酶标法Ab1-酶基团(jītuán)Ab1Ab2-酶基团(jītuán)免疫酶标法原理图第一百页，共一百一十七页。精选ppt（一）

辣根过氧化酶免疫(miǎnyì)酶标记法

辣根过氧化酶是从辣根中提取的一种糖蛋白，其作用底物为供氢体和过氧化物。目前常用的供氢体为二氨基联苯胺（DAB）。在酶反应过程(guòchéng)中DAB不断供给复发物电子，使其成为在光镜下能观察到的不溶性深棕色多聚合物。定位与酶活力处即抗原－抗体反应部分。现常用的方法有---直接法;间接法;抗体－桥联法;过氧化酶－抗－过氧化酶复合物法（PAP）;亲和素－生物素－过氧化酶复合物法（ABC）等。在组织细胞相关抗原检测中通常使用PAP法和ABC法这两种。第一百零一页，共一百一十七页。精选ppt第一百零二页，共一百一十七页。精选ppt（二）免疫碱性磷酸酶标记法碱性磷酸酶是一种磷酸酯的水解酶。从大肠杆菌中提取的此酶最适PH为8.0左右。其作用的底物有磷酸萘酚AS－MX和磷酸萘酚AS－BI，显色的偶联剂可采用固红-GBC和固蓝-BB等。免疫碱性磷酸酶染色方法(fāngfǎ)很多，有直接法；间接法；APAAP法；ABC－AP法；但APAAP法和ABC－AP法二种，较为常用，且这二种方法(fāngfǎ)其敏感性和特异性均较满意。第一百零三页，共一百一十七页。精选ppt在被检细胞(xìbāo)周围(或细胞(xìbāo)内)见到红色沉淀物，即为阳性反应CD13+第一百零四页，共一百一十七页。精选ppt免疫酶桥联(APAAP)法染色(rǎnsè)原理细胞(xìbāo)Ab-1（Mo）Ab-2（Ho）Ab-3（Mo）第一百零五页，共一百一十七页。精选pptAPAAP步骤(bùzhòu)1、固定细胞（冰冻切片或细胞涂片不需抗原修复）。2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30%H2O2)室温(shìwēn)20分钟。水洗。3、滴加正常血清37℃，30分钟。4、适当稀释的特异性抗体，37℃60分钟，或4℃过夜。5、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。6、甩桥抗体，37℃40分钟或室温1小时。7、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。8、滴加适当稀释的APAAP复合物，37℃30分钟。9、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。10、滴加AKP底物溶液，37℃15——30分钟，阳性结果显现清晰后流水冲洗。11、复染（核固红或苏木素或甲基绿）1—2分钟，常规冲洗后，封片。第一百零六页，共一百一十七页。精选pptAPAAP法APAAP：属于非标记抗体法，通过具有高特异性的抗碱性磷酸酶抗体，并在抗酶抗体中加入大量的碱性磷酸酶，使碱性磷酸酶充分结合在抗酶抗体上，形成可溶性的APAAP复合物，常用的显色剂为BCIP/NBT、固红或固蓝。特点不会与内源性过氧化物酶反应，所以背景(bèijǐng)较为干净，特别适合内源性过氧化物酶较多的组织，如肝、肾。第一百零七页，共一百一十七页。精选pptAb-1细胞(xìbāo)生物素化二抗ABC复合物生物素化Biotion（HRP/AP）ABC法染色(rǎnsè) 原理图卵白(luǎnbái)素（Avidin）第一百零八页，共一百一十七页。精选pptABC法（SP、SABC法步骤(bùzhòu)相同）ABC(avidin-biotincomeplex)卵白素-生物素复合物法属于亲和免疫组织化学技术(jìshù)，根据卵白素-生物素高亲和力的生物学特性。而S-P、SABC是以标记了过氧化物酶的抗生物素蛋白链酶素（SA）代替ABC复合物，但由于SA分子量较小，穿透性较好，反应速度较快,敏感性高，复合物也不需要使用前混合，更为简单方便。ABC为三步法，第二抗体为生物素化的IgG（或IgM、IgA等），其中的Fab片段与第一抗体结合，这就要求与第一抗体相配对，如第一抗体是鼠抗，第二抗体应该为抗鼠的（或IgM、IgA等）。由于卵白素和生物素亲和力强，故ABC较PAP敏感20-40倍。最后通过复合物上的过氧化物酶与显色反应形成有颜色的沉淀物，可用显微镜观察。第一百零九页，共一百一十七页。精选pptABC法步骤(bùzhòu)：1、固定细胞（冰冻切片或细胞涂片不需抗原(kàngyuán)修复）。2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30%H2O2)室温20分钟。水洗。3、抗原修复：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复20分钟，快速冷却.4、pH7.2TBS缓冲液洗三次。5、滴加正常血清37℃，30分钟。6、加一抗37℃，30分钟.pH7.2TBS缓冲液洗三次。7、滴加二抗，37℃，30分钟,pH7.2TBS缓冲液洗三次。8、滴加ABC复合物，37℃，反应45分钟。pH