气质联用-内标法测定豆类中脂肪酸含量及因子分析

气质联用-内标法测定豆类中脂肪酸含量及因子分析基金项目：新疆维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目（KY2015082）基金项目：新疆维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目（KY2015082）收稿日期：作者简介：钱宗耀，男，1982年出生，高级实验师，农产品质量安全及风险评估。通讯作者：帕尔哈提，男，1961年出生，高级实验师，土壤重金属污染物研究。钱宗耀，刘河疆，张维维，帕尔哈提*（新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所；农业部农产品质量安全风险评估实验室乌鲁木齐830091）摘要：对市售九种豆类（鹰嘴豆、黄豆、青豆、花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆、黑豆、红豆）中的脂肪酸组分进行含量测定研究，以十一烷酸甘油三酯为内标物，采用气相色谱-质谱联用技术对各个样品中脂肪酸甲酯组分进行分析，辅助NIST检索工具鉴定各脂肪酸组分。通过本次试验建立内标法计算豆类中脂肪酸组分含量的方法。结果表明，本次试验的豆类样品脂肪酸组分及含量均有差异，其中青豆的总脂肪含量最高，鹰嘴豆的不饱和脂肪酸含量最高。通过软件分析相关性，其中各组分间除十五烷酸外，都具有很好的显著相关性，主成分分析获得前2个主成分可以解释全部变异的98%。聚类分析将九种豆类归入四大类。该实验方法前处理简便快捷，结果准确度高，分析时间较短，可为内标法测定脂肪酸含量的研究提供借鉴。关键词：豆类；脂肪酸；气质联用；内标法；因子分析；聚类分析中图分类号：文献标识码：A文章编号：DeterminationoffattyacidsandfactoranalysisfrombeansbygaschromatographymassspectrometryusinginternalstandardMethodQianZongyao,LiuHejiang,ZhangWeiwei,Paerhati*(InstituteofAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnologyResearch,XinjiangAcademyofAgriculturalScience,Laboratoryofquality&safetyriskassessmentforagro-products(Urumqi),Ministryofagriculture,XinjiangUrumqi830091）Abstract:Studyonfattyacidcompositioninninekindsofbeanssamplesincludingchickpea、soybean、

greenpea、coloredkidneybean、dolichos

lablab、pea、mungbean、Blackbean、RedBean.UsethecompoundC11:0methylesterforinternalstandard.ThetechnologyofgasseparationoffattyacidmethylestercompositionandcompositionanalysisofNISThelpertoolstoretrievechromatography-massspectrometry.Theresultsshowed,Both

fattyacid

componentsandcontentsaredifferencebetween

ninekindsofbeans

samples

ofthisexperiment,

Itcanbeseenthatgreenbeanshadthe

highesttotalfatcontentinthosesamples,

chickpeas

hadthe

highestcontentofunsaturatedfattyacids.Throughsoftwareanalysis,thecorrelationbetweenthecomponentsofeachgroupwasverysignificantexceptC15:0,Thefirstprincipalcomponentsobtainedbyfactoranalysiscouldaccountfor98%ofallvariations.Thesinglelinkagedendrogramsbasedonprincipalcomponentvaluesdividedtheninekindsofbeansintofourclusters.Thismethodissimpleandfast,theanalytictimeisshortandtheresultisaccurate,whichcanprovidereferenceforthesimilarproductsfattyacidcontentdetermination.Keywords:beans;fattyacids;GC-MS;internalstandardmethod;factoranalysis;clusteranalysis当今社会人们对膳食结构的研究日益关注，对食品的要求也从生理需要向营养、食用健康等方面关注，豆类的品种很多，泛指所有能产生豆荚的豆科植物，是中国人的传统食品。各种豆类均含有人体必须的营养成分，有很高的食用和保健价值，可以提高人体的抵抗能力，能有效降低心脏病和癌症的发病几率[1-2]，天然食物均含有各种不同的脂肪酸成分，脂肪酸有着重要的生理功能，是人类所需的营养之一，脂肪酸的种类很多，不同脂肪酸对人体的作用各不相同，单独讨论某种或某类脂肪酸的好坏是不科学的，脂肪酸不同比例的合理摄入在一定程度上关系着人体的健康，因此研究不同食品中脂肪酸组分具有很高的营养学价值，同时对各种样品中的脂肪酸含量的准确测定也是趋势。目前根据豆类的营养素种类可将它们分为两大类。一类为高蛋白质、高脂肪豆类。另一种豆类则以碳水化合物含量高为特征，本次试验选择九种常见膳食豆类进行脂肪酸含量测定研究，较为系统的对多种豆类进行脂肪酸含量的比较，通过主成分分析和系统聚类分析进行研究。本次测定方法与传统方法相比较简便快捷，色谱分离完全，专属性好，质谱具有准确的定性功能，可完全对脂肪酸组分进行定性。通过本研究可为豆类样品的脂肪酸含量检测提供可靠的试验依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1试验对象豆类：鹰嘴豆、黄豆、青豆、花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆、黑豆、红豆：市售。1.1.2主要试剂脂肪酸甲酯混合标准品（纯度≥99%）、十一烷酸甘油三酯（纯度≥99%，5.00mg/mL)：美国Sigma公司。正己烷、甲醇：FisherScientific公司；氢氧化钾：天津盛奥化学试剂厂。1.1.3主要仪器气相色谱—质谱联用仪（配电子轰击离子源）：PerkinElmer公司；分析天平：OHAUS公司；旋涡混合器：IKA公司。1.2试验方法1.2.1脂肪酸甲酯化准确称取不同豆类样品的均匀粉末2.5g于试管中，加入内标溶液2.0mL，加入5.0mL氢氧化钾-甲醇溶液（2.0mol/L），漩涡混匀后，40℃水浴20min进行脂肪酸甲酯化，冷却至室温后分别加入5.0mL正己烷进行脂肪酸甲酯萃取，每个样品分别漩涡30s后静置分层后，取上层有机相（正己烷）稀释后用微孔滤膜(0.45μm）过滤后装进样瓶进行气相色谱—质谱仪器分析。1.2.2气相色谱-质谱联用仪条件色谱柱：FFAP（30m×0.25mm×0.5μm）；载气：氦气（99.999%）；流速：1.0mL/min；进样：1.0μL，分流比1:10；进样口温度：250℃；程序升温：初始温度80℃，以10℃/min升温至230℃，保持15min；离子化方式：电子轰击（EI）；离子化能量：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度270℃；溶剂延迟：2min；扫描范围：50～450amu；扫描方式：全离子扫描（SCAN）。1.2.3豆类样品中脂肪酸组分定性分析对混合脂肪酸标准进行全离子扫描分析，辅助NIST2011谱图库检索进行脂肪酸甲酯化合物质谱解析并确定各种脂肪酸甲酯的保留时间。通过保留时间及谱图检索匹配各种豆类脂肪酸的化学结构。1.2.4豆类样品中脂肪酸组分定量分析对测试样品的色谱图进行解析，通过以下内标法公式[3]进行计算：；式中：Xi—样品中脂肪酸甲酯i的含量%；Fi—脂肪酸甲酯i的响应因子；Ai—样品中脂肪酸甲酯i的峰面积；Ac11—样品加入内标物甲酯峰面积；Cc11—内标物浓度(mg/mL)；Vc11—样品加入内标物体积(mL)；1.0067—十一碳酸甘油三酯转化为甲酯的转换系数；m—样品的质量(mg)；Csi—混标中脂肪酸甲酯i的浓度(mg/mL)；Ac11—十一碳酸甲酯面积；Asi—脂肪酸甲酯i的峰面积。Cc11—混标中十一烷酸甲酯的浓度(mg/mL)。1.2.5统计分析方法本次试验样品均称取3份，每个样品平行测定2次，取平均值进行数据分析，涉及相关统计分析、聚类分析和方差分析方法使用SPSS22.0软件比较分析，置信区间为95%。2结果与分析2.1样品前处理方法的确定目前脂肪酸的测定试验均需要进行样品的甲酯化反应，常规的甲酯化方法有三氟化硼法、三甲基氢氧化硫法（TMSH）法、重氮甲烷、盐酸-甲醇、硫酸-甲醇和氢氧化铵-甲醇等[4-5]，以上方法均有一定的局限性。本文采用氢氧化钾-甲醇法进行甲酯化反应，通过多次试验均证明效果较好[6-7]，该方法操作过程无危害、简单快速、重现性好。

2.2脂肪酸甲酯标准品色谱分析将脂肪酸甲酯混合标准液进样，通过优化最佳的色谱条件进行分析，由气-质联用仪工作站所得的色谱图见图1。由标准色谱图可见各组分分离情况良好，内标物与其他组分也相互没有干扰，已达到定性与定量测定分析的要求。图1脂肪酸甲酯混合标准总离子流色谱图2.3色谱仪器重现性试验取同一样品重复测定3次，按试验步骤进行分析，其中各脂肪酸含量变异系数（CV）值均低于3%，表明本次试验的仪器稳定性较好，测定数据符合要求。表1重复性试验数据序号化学成分鹰嘴豆重复测定值平均值RSD（%）1C14:04.854.74.674.742.02C15:032.152.93C16:0323.1317.9335.8325.62.84C17:01.291.241.281.272.15C18:070.571.074.271.92.86C18:1(Z)1338.21347.51361.61349.10.97C18:2(Z,Z)2725.42738.62741.62735.20.38C18:3198.1196.4198.3197.60.59C20:020.521.821.621.33.310C20:17.757.887.897.841.011C22:010.29.889.779.952.22.4方法精密度试验平行称取5个鹰嘴豆样品按方法进行脂肪酸甲酯化试验，同时测定其含量并计算相对标准偏差（RSD），该值均低于8%，表明该方法精密度较高，符合试验测定的要求。2.5豆类样品中脂肪酸含量测定结果本次试验测定的九种豆类品种中均含有约10种脂肪酸成分，脂肪酸组分有近似也有差异，由内标法公式计算所得各种脂肪酸甲酯含量，以及按国家标准[3]脂肪酸甲酯转换系数的计算结果和脂肪酸相关参数对比见表2。可见不同豆类样品的含量有较大的差别，每种样品的总脂肪含量比较见图2，脂肪酸种类图比较见图3，其中青豆的总脂肪含量最高约为14990mg/100g，而试验中红豆脂肪含量最低为743mg/100g；鹰嘴豆的不饱和脂肪酸含量在本次测试样品中含量最高。表2豆类样品脂肪酸相关参数（n=3）序号保留时间化学成分平均测定含量（mg/100g）鹰嘴豆黄豆青豆花芸豆扁豆豌豆绿豆黑豆红豆110.45C14:04.745.336.560.160.650.760.673.610.00211.46C15:02.15———0.330.44——0.00312.43C16:0325.6886.9942.0174.6145.5121.0228.3579.8118.26413.36C17:01.278.608.621.310.490.890.864.290.52514.26C18:071.9790.1850.630.946.151.287.01532.019.14614.46C18:1(Z)1349.12890.83539.1169.2367.4534.3190.592540.225.58714.87C18:2(Z,Z)2735.27361.37792.8515.2820.6776.5840.185210.7395.89815.43C18:3197.61618.61813.4825.8236.8140.0274.53830.24143.19916.05C20:021.346.502.609.4829.911.251016.28C20:17.848.488.010.110.750.36—5.660.001118.53C22:09.9544.7550.524.223.30—11.4531.306.75相关参数SFA414.91694.41811.2202.6192.1168.0320.91122.8145.9MUFA1292.82762.23379.4161.3350.7509.4181.62425.525.6PUFA2793.08556.69153.81280.61007.8873.21062.55755.0539.1总脂肪含量（TG）4705.013599.414990.11716.21620.41620.61635.69723.3742.7AI（比率）0.080.080.090.180.070.21PS（比率）6.735.055.056.315.133.69注：”—”表示含量很低或未检出；SFA为饱和脂肪酸；MUFA为单不饱和脂肪酸；PUFA为多不饱和脂肪酸；AI=[C12:0+4×C14:0+C16:0]/Σ(MUFA+PUFA)为动脉粥硬化指数；PS=PUFA/SFA。图2豆类样品总脂肪含量比较不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）。下同。图3不同脂肪酸种类比较2.6测定脂肪酸组成指标间的相关性分析本次试验测定的11项脂肪酸组成指标间经过软件分析相关性结果见表3，通过分析各种脂肪酸组分及含量相关性，发现除十五烷酸不具有相关性，其他脂肪酸组分都具有很好的极显著相关性，为分析提供很好的数据支持。表3相关系数矩阵组分肉豆蔻酸十五烷酸棕榈酸十七烷酸硬脂酸油酸亚油酸亚麻酸花生酸花生一烯酸十五烷酸0.239棕榈酸0.906**-0.183十七烷酸0.845**-0.2840.985**硬脂酸0.843**-0.3120.986**0.986**油酸0.939**-0.0670.969**0.937**0.959**亚油酸0.929**-0.1220.992**0.970**0.980**0.989**亚麻酸0.741*-0.3840.924**0.956**0.925**0.850**0.887**花生酸0.949**-0.0470.987**0.951**0.957**0.973**0.991**0.860**花生一烯酸0.979**0.3240.860**0.792*0.787*0.899**0.893**0.676*0.920**山嵛酸0.859**-0.2800.989**0.973**0.988**0.949**0.976**0.914**0.965**0.804***表示显著相关（P<0.05）；**表示极显著相关（P<0.01）。2.7豆类样品主成分分析2.7.1相关系数矩阵特征值和累积贡献率分析主成分分析可以将具有复杂关系的变量，通过降维而反映出相应的内在联系，从而选择少数具有主导作用的独立变量。本次试验数据通过软件处理得到的结果见表4，根据累积贡献率达到85%以上，信息损失量在15%以下的原则，通过分析可以得出以下结论：在选择前2个主成分分别解释总变异的84.6%和13.6%，则累积贡献率就可以达到98.2%，因此可以将前2个定义为第1主成分和第2主成分。表4相关系数矩阵特征值和累积贡献率主成分特征值总变异比例(%)累积贡献率(%)19.30784.60784.60721.49113.55798.1632.7.2主成分的特征向量通过软件进行主成分分析可以得到主成分特征向量值和因子载荷图，分别见表5和图4，从数据结果可以看出第1主成分包括肉豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、花生一烯酸、山嵛酸；第2主成分包括十五烷酸。其中十七烷酸、花生酸、花生一烯酸、二十二烷酸虽然含量较小，却是不同品种间的特征脂肪酸，可为不同品种豆类的鉴定提供一定依据。表5主成分的特征向量序号组分第1主成分第2主成分1肉豆蔻酸0.9270.3672十五烷酸-0.1340.9873棕榈酸0.997-0.0514十七烷酸0.978-0.1635硬脂酸0.981-0.1786油酸0.9820.0757亚油酸0.9970.0188亚麻酸0.911-0.2909花生酸0.9900.09110花生一烯酸0.8860.45211山嵛酸0.981-0.144图4主成分因子载荷图2.8豆类样品聚类分析探讨豆类样品的品种不同，其脂肪酸组成和含量也有一定的差异，对此以脂肪酸含量作为变量对试验对象进行聚类分析探讨，基于软件得出的聚类图（图5）将本次试验豆类样品分为四大类，其中黄豆和青豆一类；花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆和红豆归为一大类；鹰嘴豆和黑豆各成为独立类。图5九种豆类样品的单联树状聚类图3讨论与结论随着对豆类食用价值与营养品质的不断研究，发现由多种特性决定，本研究主要以脂肪酸组分及含量作为特性指标建立分析模型，在对试验的九种豆类进行相应的分析后可以发现豆类含有丰富的脂肪酸，并且脂肪酸组分含量及相对比例也有很大的区别，某些特征性脂肪酸虽然含量较低，但对人体健康具有一定的保健功效，比如肉豆蔻酸能减少前列腺增生发生的几率[8]。不饱和脂肪酸对人体血脂和心血管疾病的影响已得到广泛的研究[9]，富含不饱和脂肪酸的食品可有效降低血脂、预防心血管疾病的功效[10]，被推荐给该疾病的高危人群食用。亚麻酸具有降血压、抗动脉粥样硬化和益智等保健功效，亦是多不饱和脂肪酸的母体，在体内可以转化为DHA、DPA、EPA等人体所必须的脂肪酸[11]。这些特征性脂肪酸是评价脂肪酸甲酯的重要指标，同时对不同豆类的品质及鉴定有重要影响，通过本次研究可对不同豆类品质评价工作提供一定的科学依据。在脂肪酸与人类疾病相关研究中，饱和脂肪是导致心血管疾病高发的膳食品种，此次试验结果在相关参数统计中引入动脉粥硬化指数(AtherogenicityIndex)比率[12]仅供参考，该值越低表明该类膳食种类具有较好的抗动脉粥硬化的作用，从本次研究可以看出：青豆、黑豆、鹰嘴豆与黄豆均有较低的比率，作为保健食品在人类长期饮食习惯及科学研究[13-15]结果均与此次研究结果符合。本次试验通过气质联用-内标法对豆类样品的脂肪酸含量进行测定研究，从所得到的数据结果可以看出，各种豆类的脂肪酸种类和含量均具有显著的差异；结合统计软件分析，各组脂肪酸成分具有很好的相关性，由于不同的豆类所含脂肪酸的差异，选取合适的主成分可以更加突出脂肪酸信息的特征性，在对本次试验各种豆类进行聚类-主成分分析时，得到很好的聚类识别，可将目前试验的豆类分为四大类。但由于植物种类的多样性，脂肪酸成分和含量的不确定性，基于脂肪酸信息分析识别种类的研究还需要深入地研究。参考文献：[1]李曦,陈明远,营养与食品卫生[M].北京:旅游与教育出版社,2000:50.[2]李铎.食品营养学[M].北京:化学工业出版社.2011:197.[3]GB/T22223-2008.食品中总脂肪、饱和脂肪（酸）、不饱和脂肪（酸）的测定水解提取-气相色谱法[S].2008.[4]庄俊钰,冯志强,谢忠阳.气相色谱内标法测定深海鱼油中的EPA和DHA[J].现代食品科技.2009,25(11):1363-1365.[5]吴伟都,金世梅,朱慧.气相色谱内标法测定奶粉及乳饮料中的DHA和EPA[J].食品科技.2000,(6):56-57.[6]钱宗耀,曹晓倩,王成.气质联用法分析鱼油胶囊中脂肪酸组成[J].粮油食品科技.2014,22(6):44-45.[7]钱宗耀,郑伟华,华震宇,王成.气质联用技术分析玫瑰花中脂肪酸组成[J].江苏农业科学.2014,42(2):241-242.[8]VeereshBabuSV,VeereshB,PatilAA,etal.Lauricacidandmyristicacidpreventtestosteroneinducedprostatichyperplasiainrats[J].EuropeanJournalofPh