原核实验鉴定报告

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌鉴定报告生物班实验目的利用大肠杆菌和枯草芽抱杆菌的特性将其从环境中分离出来，并通过一系列特定的生理生化实验鉴定分离菌株。一实验材料和方法实验材料大肠杆菌（Escherichiacoli）枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis）大肠杆菌样品（人粪便样品）枯草芽抱杆菌样品（菜地土样品）实验方法及原理分离纯化-大肠杆菌（原理：利用大肠杆菌发酵乳糖产生酸的特性，用一种含有乳糖及指示剂的培养基可以将其分离、纯化出来，本实验用曙红一亚甲兰一乳糖琼脂培养基。大肠杆菌在此培养基上是黑色并有金属光泽的菌落。）分离纯化-枯草芽抱杆菌（原理：枯草杆菌是一种好氧的产芽抱杆菌，由于其抱子能抗高热（有的种在100°C下3小时才能被杀死），所以利用加热处理杀死不产抱子的其他菌类，从而得到产抱子的细菌。）氧化酶鉴定-氧化酶（原理：对氨基二甲基苯胺玫瑰红一暗紫色）假单胞菌属等大多是氧化酶阳性反应。O2细胞色素C-过氧化氢酶（原理：h2o2h2o过氧化军要用于区分好氧细菌与厌氧细菌-M.r和V.P（原理：葡萄糖丙酮酸（加入甲基红试剂呈现阳性红色）乙酰甲基甲醇—乙酰甲基甲醇+2CO2二乙酰一＞+KOH，+H+蛋白豚中的精氨酸呱唧"红色化合物（阳性反应）-石蕊牛奶（原理：牛奶主要含乳糖和酪蛋白，可以测定细菌生物化学特性，石蕊既是酸碱指示剂也是氧化还原指示剂。产酸——发酵乳糖产酸，使石蕊变红'产碱——分解酪蛋白，产生氨等碱性物质，使石蕊变篮'胨化——产生蛋白酶使酪蛋白分解，从而使牛奶变得澄清透明\酸凝固一当产酸浓度较高时，可使牛奶凝固\还原一一生长旺盛使培养基氧化还原电位降低，使石蕊退色\上述几种反应中，石蕊均可被还原）-细菌对色氨酸的利用（原理：有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白豚中的色氨酸产生吲哚。吲哚本身无颜色，加入对二出氨基苯甲醛试剂时，则能形成红色的玫瑰吲哚。反应式如下：L一色氨酸+H2O色氨酸酶吲哚+丙酮酸吲哚+对二甲基氨基苯甲醛红色玫瑰吲哚+H2O）-丙二酸盐利用实验（原理：某些细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源，这也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。若细菌利用丙二酸钠生成碳酸钠，呈碱性，培养基生长由绿变蓝，为阳性结果；如果未变色，为阴性结果。）-葡萄糖和甘露醇发酵实验（原理：细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一的碳源，反映该细菌是否产生代谢这种含碳化合物的有关的酶，因而可作为分类鉴定的特性。细菌分解糖产生有机酸，因此在培养基中加入适当的指示剂，酸性即能显示出来。细菌分解糖产气的性能主要是指CO2和H2等发酵最终产物，所产生气体可用杜兰管倒置在试管培养液中收集。）-柠檬酸盐的利用（E.coli）（原理：肠杆菌科各属利用柠檬酸钠作为唯一碳源的能力不同，因此能否利用柠檬酸钠是一项鉴别性特征。柠檬酸钠CO2TN^（呈碱性）BTB变蓝-硝酸盐还原（B.subtilis）（原理：某些细菌能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨和氮等。如果培养基中含有亚硝酸盐，当加入格瑞斯试剂时，培养液会呈现粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等。）-水解淀粉实验（B.subtilis）（原理：细菌淀粉酶能将遇碘呈蓝色的淀粉水解为遇碘不显色的无色糊精等小分子。）-pH5.7生长（B.subtilis）（原理：不同的细菌对PH值的适应性不同。因此可以作为细菌鉴别的特征。）-7%NaCl生长（B.siMlis）（原理：该实验主要用于观察渗透压对细菌生长的影响。不同的细菌耐盐性不同，因此可以此作为鉴别特征。）二.鉴定结果一：文字分析：1.分离纯化分析E.coli四个稀释梯度（10-4,10-5,10-6,10-7）各两个重复，其中每个梯度各有一个培养皿重复被麦胞菌污染，剩下每个梯度各一个培养皿上均没有生长任何菌落（最终借助钱碧莲小组10-3浓度培养皿观察分析）分析如下：分离得到的大肠杆菌菌落呈圆形，表面凸起光滑，墨绿色，具有金属光泽。B.subtilis五个稀释梯度（10-3〜10-7）各两个重复，生长了数量较多形态各异的园洛。随着接种菌液浓度的降低，菌落数量减少。观察分析：菌洛呈灰白色，表面暗淡没有光泽，表面粗糙，边缘不规则；2.鉴定分析（四种菌株大肠杆菌模式菌株组/分离组/枯草芽抱杆菌模式菌株组/分离组/）E.coli1E.coliB.subtilis1B.subtilis氧化酶实验——+++—过氧化氢酶实验++++++M.R实验+（颜色偏粉）++（颜色偏黄）+V.P实验——+—石 颜色反应乳白色乳白色一一粉乳白色一一黄乳白色一一黄蕊 （由下到上）粉色色色——紫色色 紫色色 紫巴牛豚化++++++++++++奶酸凝固++++++++实还原++++（一天++++（一天全++++验全部褪色）部褪色）丙二酸利用实验++++++

色氨酸利用实验++——糖和醇发酵试验葡萄糖产酸，有一管E.coliT产气产酸，产气产酸，有一管B.subtilisT产气产酸，不产气甘露醇产酸，产气产酸，产气产酸，不产气产酸，不产气柠檬酸盐利用实验————一硝酸盐还原实验++水解淀粉实验++pH7.0生长实验+++7%NaCl生长实验+++:图形结果展示:图1大肠杆菌和枯草芽抱杆菌分离实验菌落形态图图3M.R.实验结果图4V.P实验结果图5石蕊牛奶实验图6丙二酸盐利用实验结果图7色氨酸利用实验结果图8A、葡萄糖利用结果；B、C,甘露醇利用结果B.sB.s图9A硝酸盐利用实验；B.pH7.0生长实验；C.7%NaCl生长实验D.水解淀粉实验被污染培养基，显示抑菌圈；E.水解淀粉实验三.讨论和结论鉴定结果：由生理生化实验鉴定结果可以看出，实验分离得到的菌与模式菌株在生理生化指标上基本一致，没有较大出入。可初步判定实验分离得到的确实为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。实验分析实验分离得到的E.coli与模式菌株生理生化指标基本一致，没有明显差异，说明实验分离大肠杆菌基本正确，且生活力与模式菌株相比无较大差异，分离纯化较为成功。实验分离得到的B.subtilis菌与模式菌株在一些生理生化实验中还存在着一些细微的差别。如V.P.实验中，B.subtilisT实验结果呈阳性，而B.subtilis实验结果则呈阴性；丙二酸盐利用实验中B.subtilisT溶液颜色变化非常明显呈蓝色，而B.subtilis则变化并不明显，且有一平行试管溶液颜色没有发生变化；葡萄糖发酵实验中B.subtilisT菌株利用葡萄糖发酵产气，而B.subtilis则不产气；pH7.0生长实验和7%NaCl生长实验中，B.subtilisT的菌落均远大于B.subtilis的菌落且生长旺盛。由上述结果可以得知，实验中分离得到的枯草芽抱杆菌生活力较弱，因此在一些生理生化试验指标的检测中反应较弱，与模式菌株有差异。分析原因可能为采集样本时间较早，菜地土中枯草芽抱杆菌总体生命力并不旺盛，因此分离得到的菌株生活力较弱。实验问题1） 实验中为保证实验结果的可信度，每一种菌株在每个实验中均设置2〜3个平行。但是实验同一菌株的平行性并不是很好，可能存在接种菌量差距，造成实验平行性较差。2） 在使用固体培养基分离和鉴定实验（水解淀粉实验）过程中均有不同程度的污染出现，可能无菌操作不严格，导致培养基污染实验反思：实验中使用不同浓度的菌液进行大肠杆菌和枯草芽抱杆菌的分离和纯化。从分离结果可以看