第二十二章病毒增殖与人工培养

第二十二章病毒的增殖与人工培养第一节

病毒的增殖病毒不能独立增殖，其增殖只能在活细胞内进行。由宿主细胞提供原料、能量、生物合成的场所和一部分酶类，在病毒核酸的控制下，以其自身基因为模板，来合成病毒的核酸及蛋白质等成分，然后在宿主细胞浆或细胞核内组装成完整的病毒颗粒，再以不同的方式释放到细胞外，感染其他的细胞，这种增殖方式称为复制(replication)。一个完整的复制周期包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与释放等步骤。6、翻译早期蛋白7、复制子代病毒DNA8、晚期mRNA转录9、翻译子代病毒蛋白10、子代病毒的装配与成熟11、释放细胞生物合成病毒的复制周期病毒的复制周期一、吸附吸附（adsorption）是病毒结合到细胞表面上的过程，是复制的第一步，吸附过程可分两个阶段：①非特异性吸附是病毒与细胞靠静电作用而发生的一种可逆性结合。②特异性吸附是病毒结构与宿主细胞相应受体的结合，是不可逆的。病毒的吸附可在几分钟至几十分钟内完成，通常多在60分钟内完成。病毒受体：病毒受体（virusreceptor）是指宿主细胞膜上与相应病毒结合的特殊结构物质，不同病毒的受体物质有所不同，但多为糖蛋白。二、穿入与脱壳穿入(penetration)是病毒体进入细胞内的过程。脱壳(uncoating)是病毒粒子脱掉囊膜和衣壳，游离出核酸的过程，无囊膜病毒只有脱衣壳过程。穿入脱壳（一）穿入病毒体穿入细胞的方式：①通过胞饮作用进入，如痘病毒。②病毒的囊膜与细胞膜融合，核衣壳直接进入胞浆，如正粘病毒。③病毒与细胞膜上受体相互作用，使核衣壳进入胞浆，如脊髓灰质炎病毒。④有的病毒能以完整的病毒颗粒直接挤入细胞浆，如呼肠孤病毒。（二）脱壳

1、脱囊膜方式①在细胞表面脱囊膜，有些病毒的囊膜能与细胞膜融合，而向细胞中释放核衣壳，如正粘病毒、副粘病毒、疱疹病毒。②在吞饮泡内借助溶酶体酶的作用脱掉囊膜，如痘病毒。2、脱衣壳方式①有些病毒穿入时，于细胞膜表面脱衣壳，使病毒核酸直接进入细胞内，如肠道病毒。②有些病毒在吞饮泡内经溶酶体酶的作用脱掉衣壳，如流感病毒、痘病毒等。③有的在核膜脱壳，如腺病毒被吞饮进入胞浆后，从吞饮泡释放，进而向核膜的核孔复合物贴近，病毒的基因组及部分衣壳蛋白从衣壳中逸出，通过核孔复合物进入核内。④有些病毒的衣壳并不完全脱去，脱掉外衣壳后，以整个核心进行转录和复制，如呼肠孤病毒。三、生物合成病毒的生物合成，发生在隐蔽期。包括核酸的复制、mRNA的转录、病毒结构蛋白的合成以及早期功能蛋白（酶类）的合成。隐蔽期：病毒脱壳释放核酸后，此时在

细胞内已看不到病毒颗粒，直至数小时

后子代病毒出现，这段时间称为隐蔽期。不同的病毒隐蔽期长短不同，一般持续

2～12h。生物合成根据病毒的核酸类型及转录复制方式，将动物病毒分为七种类型：双股DNA病毒

单股DNA病毒

DNA反转录病毒

RNA反转录病毒双股RNA病毒单股负股RNA病毒单股正股RNA病毒（一）双股DNA病毒

1、痘病毒、非洲猪瘟病毒及虹彩病毒等在胞浆复制，它们不仅携带自备的转录酶

(依赖于DNA的RNA聚合酶)，而且基因组较大，不依赖细胞核能编码多种酶，病毒DNA可直接转录mRNA。2、疱疹病毒、腺病毒、多瘤病毒及乳头瘤病毒等，病毒DNA在细胞核内复制，在细胞的依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ的催化下转录mRNA。病毒DNA早期mRNA早期蛋白（酶等）子代病毒DNA晚期mRNA病毒结构蛋白子代病毒双股DNA病毒生物合成示意图复制转录酶翻译翻译转录装配早期晚期解链正链DNA负链DNADNA多聚酶子代DNA（二）单股DNA（ssDNA）病毒如细小病毒及圆环病毒，利用细胞的

DNA聚合酶合成双股DNA，然后在细胞核内的依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ的催化下转录mRNA。复制解链 半保留复

制保留复制转录 翻译装配（三）DNA反转录病毒嗜肝病毒基因组部分为双股DNA，部分为单股。首先在病毒依赖的DNA聚合酶作用下合成互补链,形成一个完整的超螺旋双股DNA。然后在细胞的RNA聚合酶Ⅱ的催化下转录、产生全长的正股RNA。由正股RNA翻译病毒转录酶并作为负股

DNA的模板复制负股DNA，后者则作为合成双股DNA的模板复制双股DNA，而后双股DNA转录mRNA。DNA聚合酶形成转录酶翻译反转录装配（四）RNA反转录病毒反录病毒具有单股RNA，但不具备mRNA的功能，它在病毒依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)

的作用下转录，首先产生一个RNA-DNA杂交分子，然后在同一酶的作用下形成双股DNA，并插入细胞DNA基因组。此种插入的病毒DNA称为前病毒(provirus)，在细胞的RNA聚合

酶Ⅱ的作用下转录mRNA，然后进行翻译，所获蛋白质裂解成为病毒蛋白。另外转录的某些全长正股RNA两两结合，形成子代病毒颗

粒的二倍体基因组。反转录酶转录酶转录复制翻译（五）双股RNA病毒呼肠孤病毒及双RNA病毒具有分节段的双股RNA基因组。先在RNA聚合酶的作用下，不对称地转录出一条单链RNA，此时母代RNA完全保留下来。新形成的单链RNA在大小上与各基因组片段相等，其中大多数直接作为mRNA，去翻译病毒蛋白，另一些作为合成子代RNA模板，进而合成子代双股RNA。病毒RNAmRNA装配翻译RNA聚合酶不对称转录复制病毒蛋白质子代病毒子代RNA双股RNA病毒生物合成示意图（六）单股负股RNA病毒核酸为单股RNA，但母代RNA不能直接呈现

mRNA的作用，故称负股。1、副粘病毒、弹状病毒、丝状病毒及波纳病毒均为负股不分节段的RNA，携带依赖于RNA的RNA聚合酶(转录酶)，可转录与之互补的正股RNA，正股RNA即可作为mRNA，又可作为复制子代RNA的模板合成子代病毒负股RNA。2、正粘病毒、布尼病毒及砂粒病毒具有分节段的负股RNA，在病毒携带的转录酶的作用下，每个节段各自进行转录，产生与之互补的正股RNA，正股RNA即可作为mRNA，又可作为复制子代RNA的模板合成子代病毒负股RNA。负单链RNA依赖RNA的RNA多聚酶子代RNA双链RNA（复制中间型）解链——

＋负单链RNA—＋复制正单链RNA（有mRNA功能）翻译结构蛋白装配子代病毒负单链RNA病毒生物合成示意图（七）单股正股RNA病毒核酸均为单股RNA，但母代RNA可直接作为mRNA翻译蛋白质，故称正股RNA。此类病毒包括微RNA病毒、黄病毒、披膜病毒、嵌杯病毒、冠状病毒及动脉炎病毒等。基因组可直接作为mRNA，翻译病毒结构与非结构蛋白，包括依赖于RNA的RNA聚合酶。在该酶作用下获得病毒RNA的互补链，后者又可作为合成子代正股RNA的模板。正单链RNA复制子代RNA衣壳蛋白非结构蛋白（依赖RNA的RNA多聚酶）双链RNA作为mRNA翻译＋（复制中间型）＋

－—＋＋子代病毒复制装配正单链RNA病毒生物合成示意图四、装配与释放装配——病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。释放——新组成的病毒粒子从细胞内释放到细胞外。（一）装配细胞核内病毒的装配部位细胞质内核膜上

胞质膜上绝大多数DNA病毒均在细胞核内组装，RNA病毒和痘病毒在细胞浆内组装。（二）释放

1、无囊膜病毒大多数无囊膜的病毒蓄积在胞浆或核内，当细胞完全裂解时，一次性释放出病毒颗粒。2、有囊膜病毒有囊膜的病毒以出芽的方式成熟、逐个释放。多数病毒从胞浆膜出芽、部分病毒从核膜出芽，也有的从胞质内膜出芽。第二节

病毒的人工培养培养方法动物培养鸡胚培养细胞培养一、动物培养即将病毒或含病毒材料接种在易感动体内，使病毒在动物体内增殖，这是最原始的病毒培养法。动物选择：自然易感动物（本动物）实验动物（易种动物）常用的实验动物有家兔、小白鼠、豚鼠、大白鼠、地鼠等。接种途径：滴鼻、点眼、口服、皮下注射、皮内注射、腹腔注射、肌肉注射及静脉注射。应根据病毒种类选择不同的敏感动物及合适的接种途径接种。接种后观察：每日观察动物的发病、死亡等情况，动物死后取病变组织制成悬液在低温下保存或继续传代与鉴定。二、鸡胚培养即在鸡胚中培养病毒。一般用孵化6～14日龄的鸡胚，按病毒种类的不同接种于鸡胚的不同部位。来自禽类的病毒均可在鸡胚中生长，来自哺乳动物的病毒有些也能在鸡胚中生长。常用接种方法：

1、绒毛尿囊膜接种2、尿囊腔接种3、卵黄囊接种4、羊膜腔接种鸡胚接种示意图鸡胚接种病毒后可能出现的变化：①鸡胚死亡②胚胎上有出血点或胚胎畸形、发育受阻③绒毛尿囊膜上出现斑点或斑块（痘斑）④尿囊液、羊水、卵黄囊中出现病毒抗原接种后鸡胚发育矮小,蜷缩接种后鸡胚体表出血三、细胞培养即利用离体的活细胞培养病毒。在体外利用离体的的动物组织、器官或细胞培养病毒称组织培养。组织培养有3种方法：组织块培养器官培养细胞培养（目前使用的方法）（一）细胞培养的特点细胞培养中每个细胞的生理特性基本一致，对病毒的易感性也相等，没有实验动物的个体差异。而且可用于试验的数量远远超过动物或鸡胚，并且可在无菌条件下进行标准化的试验，且重复性好。感染细胞可通过观察细胞病变（CPE）判定结果，也可结合免疫学技术检测细胞内是否有所培养的病毒。方便分离病毒以及病毒克隆。从样本分离的病毒可能不是单一的毒株，需要克隆以求纯化。通过细胞培养挑选产生的空斑可达到克隆的目的。（二）细胞培养的类型

1、原代细胞(primarycell)用动物组织直接制成的单层细胞称原代细胞。如鸡胚成纤维细胞、地鼠肾原代细胞和猪睾丸原代细胞等。原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。原代细胞的制备（鸡胚成纤维细胞）取9～11日龄鸡胚无菌取出胚胎，去头、爪、翅、内脏

Hank，s液洗涤3次剪碎（0.5cm3大小）Hank，s液洗涤3次弃掉洗涤液，加入消化液（0.25%胰蛋白酶液）37℃水浴消化10min弃掉消化液，加入营养液吹打，制成细胞悬液分装培养瓶

37℃培养24～48h细胞长成单层2、二倍体细胞株(diploid

cell

strain)将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体时称二倍体细胞株。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性则基本无变化。从样本中分离培养病毒，一般多采用此种细胞。3、传代细胞系(established

cell

line)是指用肿瘤组织制成的或由正常二倍体细胞突变后形成的单成细胞，这类细胞在体外可无限制分裂、无限制传代，故称传代细胞系。优缺点：优点

细胞传代及培养病毒方便，因此使用广泛。缺点有的对分离野毒不敏感。因在实验室传代日久，有的可能污染支原体或隐性感染的病毒。由于担心致肿瘤的潜在危险，传代细胞系一般不能用于制备疫苗。传代细胞系一般有通用的名称及代号，并有专门机构负责鉴定和保管。如：HeLa(人子宫癌细胞)

Vero(非洲绿猴肾细胞)

BHK-21(乳仓鼠肾细胞)

PK-15(猪肾细胞)（三）细胞培养的方法最常用的方法为静置培养及旋转培养。为满足某些特定的需要，还可采用悬浮培养或微载体培养技术等。1、静置