医学分子生物学核酸分离纯化课件

人的差异在于业余时间15052医学分子生物学4核酸分离纯化课件15052医学分子生物学4核酸分离纯化课件人的差异在于业余时间15052医学分子生物学4核酸分离纯化课件医学分子生物学

课堂作业（3）：

电泳结果图比较分析M123456图1基因组DNA电泳图2质粒DNA电泳图3RNA电泳真核细胞的裂解方法包括超声破碎法、匀浆法、低渗法等物理方法及蛋白酶K、去污剂温和处理法，为获得大分子量的DNA，一般多采用后者温和裂解细胞。

1.真核细胞基因组DNA的分离纯化方法：

酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法及各种快速方法。

酚抽提法1976年创立，经改进：以含EDTA、十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate，SDS）及无DNase的RNase裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K（proteinaseK）处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，乙醇沉淀，获得DNA粗制品。去除蛋白质、RNAEDTA为二价金属离子螯合剂，可抑制DNA酶的活性，同时还能降低细胞膜的稳定性；SDS为阴离子去污剂，能引起细胞膜降解，乳化脂质和蛋白质并沉淀，同时还有降解DNA酶的作用；

无DNA酶的RNA酶，可有效水解RNA；蛋白酶K起水解蛋白质的作用，可消化DNA酶、DNA上的蛋白质，同时也有裂解细胞的作用。

酚抽提法：试剂作用（一）酚是很强的蛋白质变性剂，也可抑制DNA酶活性；氯仿能加速有机相和水相的分离；异戊醇则可减少在抽提过程中由于蛋白变性产生的大量气泡。pH8.0的Tris可使DNA顺利进入水相，避免滞留于蛋白层。

70％乙醇洗涤（除去共沉淀的盐和有机分子）

酚抽提法：试剂作用（二）基因组DNA的提取步骤：消化缓冲液（含蛋白酶和RNA酶）酚/氯仿/异戊醇（反复多次）无水乙醇/醋酸钠（浓缩）TE液溶解保存（70－75）％乙醇洗涤沉淀和洗涤后的痕量乙醇必须去除干净，否则影响随后的DNA溶解以及酶学反应。

(1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。

Tris饱和酚(吸取下层溶液)(2）安全操作酚腐蚀性很强，可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。酚使用注意事项基因组DNA片段的纯化DNA粗制品实际上是分子量大小不等的DNA片段的混合物，难免还混有少量的RNA、蛋白质和一些小分子杂质。某些实验，如限制性内切酶酶切反应、分子克隆、体外转录及基因组文库的构建等对DNA制品的纯度及完整性要求较高，这就要求对粗制品进一步纯化。

基因组DNA片段的纯化

纯化方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀等。电泳法由于简便、易于操作、分辨率高、灵敏度好、易于观察及便于回收等优点。琼脂糖凝胶电泳（AGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）。

第一节核酸的化学组成第二节核酸分离纯化的设计及原则第三节真核细胞基因组DNA的分离纯化第四节质粒DNA的分离纯化第五节真核细胞RNA的分离纯化一、核酸的分离纯化

DNA

RNA独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复制和遗传的辅助性遗传单位。

质粒与致病菌的毒力及耐药性有关，又是基因工程的常用载体。第四节质粒DNA的分离纯化

质粒（plasmid）存在于染色体外胞质中，能独立复制并稳定遗传的小的核酸分子。第四节质粒DNA的分离纯化

与染色体DNA分离（质粒较小，共价闭合环状）

与蛋白质、RNA分离

质粒载体（plasmidvector）细菌中提纯质粒DNA的方法3个步骤：

细菌培养物的生长(质粒扩增）

细菌的收获（离心）和裂解

质粒DNA的纯化

细菌培养

细菌培养至对数生长期（OD600）时提取质粒DNA。

减少细菌量，降低后续操作中裂解物的复杂性和粘稠度。

细菌裂解可采用离心的方法来收集细菌，由于细菌生长中产生了大量的代谢产物，为提高质粒DNA的纯度，细菌沉淀最好用STE或生理盐水漂洗1～2次。细菌的裂解可采用多种方法进行，如SDS裂解法、有机溶剂法、碱裂解法、煮沸裂解法、溶菌酶法和超声处理等。

取决于３个因素

质粒的大小菌株种类裂解后纯化质粒DNA的技术细菌裂解方法的选择大于15kb的质粒易受损，应采用温和裂解法，如SDS裂解法，将细菌悬浮于10％蔗糖溶液中可减轻裂解时对DNA造成的机械剪切力。一些大肠杆菌菌株（如HB101、TG1等）含较多糖类，用SDS或煮沸裂解时会大量释放出来，若随后用CsCl-EB梯度平衡离心进行质粒纯化时，糖类会很难与质粒DNA区分开来，而糖类也可抑制多种限制酶的活性。HB101等菌株能表达核酸内切酶A，且煮沸不能完全灭活，在Mg2+条件下可以降解质粒DNA，不建议使用煮沸法。若一定要使用煮沸法提取该类菌株中的质粒DNA，可采用酚/氯仿反复抽提，以除去该酶。细菌裂解方法的选择

强碱破坏碱基配对，使线状染色体DNA解链，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新形成完全天然的超螺旋分子。碱裂解法:利用质粒DNA和染色体DNA的变性与复性的差异达到分离目的在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA和SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。细胞被裂解后，细胞壁及膜的碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成缠连的、不溶性的网状、大的复合物，在高盐条件下可有效沉淀；当pH调至中性时，质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋，保留在上清液中，经离心可与染色体DNA分离。使用预冷无水乙醇沉淀上清液中的质粒DNA，再用70%的乙醇洗涤。碱裂解法:碱裂解法操作步骤:溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ⅱ（NaOH，SDS）溶液Ⅲ（乙酸/乙酸钾）酚/氯仿/异戊醇无水乙醇沉淀TE液溶解

OD260/280=1.6－1.8;>2.0表示含有RNA，<1.6表示有蛋白质等碱裂解法

操作简单、重复性好、成本低廉。用于高拷贝质粒（如Xf3或pUC）的制备其产量一般约为3～5μg/ml菌液；制备量可大可小，是使用最广泛的方法；制备的质粒DNA可用于DNA重组、常规亚克隆、探针标记、限制性酶切图谱绘制以及细菌转化等实验。沉淀和洗涤后的痕量乙醇必须去除干净，否则影响随后的DNA溶解以及酶学反应。

煮沸裂解法将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞膜，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清液中的质粒DNA。条件剧烈，只适于小质粒DNA（<15kb）的提取。SDS裂解法

将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁和细胞膜，再用SDS裂解去壁细胞，从而温和地释放质粒到等渗液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA。条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。一.碱裂解法利用质粒DNA和染色体DNA的变性与复性的差异达到分离目的,最广泛使用,适用于所有菌株。二.煮沸裂解法三.SDS裂解法

条件温和，特别适用于大质粒DNA（>15kb）的提取。缺点是产率不高。条件剧烈，只适于小质粒DNA（<15kb）的制备。有些菌株不适用。质粒DNA提取方法的比较常规小量或中量制备的质粒DNA可用于酶切回收、探针标记、重组或转化等分子生物学操作。有些实验对质粒的纯度要求更高，如哺乳动物转染、转基因动物等实验，对质粒DNA的闭合环状构型要求较高，因此需要对提取的质粒进行进一步的纯化。无论用何种方法提取的质粒DNA，都会有不等量的染色体DNA和较多RNA、蛋白质残留其中。制备的质粒也有三种不同构型，即：共价闭合环状、线性和半开环。质粒DNA的纯化去除蛋白质、染色体DNA和RNA；分离质粒的不同构型；

质粒DNA纯化目的利用质粒DNA相对较小及共价闭合环状两个性质质粒DNA的纯化方法氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心；离子交换层析、凝胶过滤层析；聚乙二醇沉淀法；氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心利用溴化乙锭同线性和闭合环状DNA分子的结合量不同，导致不同构型DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯梯度中的浮力密度有所差异，从而达到分离纯化的目的。适于纯化：①容易带上切口的特大质粒；②用于转染哺乳动物细胞的闭环质粒；③用于生物物理学测定的质粒。是大量制备质粒的首选方法

。

缺点：昂贵且费时

聚乙二醇沉淀法

利用质粒相对较小和共价闭环的结构特点进行分级沉淀的纯化方法。1）用LiCl（强脱水剂，能降低RNA的溶解度，使蛋白质从染色质上脱离）沉淀粗制品中的大分子RNA和蛋白质，并用RNase消化小分子RNA；2）含有聚乙二醇（PEG）的高盐溶液选择性地沉淀大的质粒DNA，使小分子RNA和染色体DNA片段留在上清液中；3）沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀而得到纯化。小分子RNA与DNA片段的去除小分子RNA与DNA片段的污染，能够提供相当多的5’与3’末端。利用DNA末端的酶促反应（如末端转移酶、T4DNA连接酶）和测序反应等实验很关键。用分子筛层析或RNase消化等方法去除污染。第一节核酸的化学组成第二节核酸分离纯化的设计及原则第三节真核细胞基因组DNA的分离纯化第四节质粒DNA的提取与纯化第五节真核细胞RNA的分离纯化一、核酸的分离纯化

哺乳动物细胞的RNA分布

rRNA的数量最多，占80％～85％（主要分为28S、18S、5.8S和5S四种）；低分子量RNA如tRNA、snRNA等占15％～20％；

mRNA仅占1％～5％;

第五节真核细胞RNA的分离纯化RNA许多分子生物学实验如Northernblot、cDNA合成以及体外翻译等都以RNA为材料和研究对象，因此从细胞中分离出足够数量、纯度和完整性的RNA是至关重要的，它直接影响到实验的结果。RNA化学性质更为活跃：与DNA相比，核糖残基在2’，3’位带有羟基。主要为单链结构。易受RNA酶（RNase）的切割。

RNA制备的条件与环境RNA极易被RNase水解！

RNase

广泛存在于人的细胞内、皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；分子结构中二硫键的存在使其生物学活性非常稳定，煮沸及一般变性剂不能使其完全灭活，待变性剂去除后，活性又可恢复。

RNase污染的防止RNA制备中最关键的因素是严格控制制备的条件和环境，防止RNase的污染！！排除RNase的存在,强有力地抑制其活性一是避免外源性RNase的污染，它主要来源于试剂、实验器皿和操作者本身；二是抑制内源性RNase的活性，它主要来源于样品中的组织细胞。

RNase的变性剂酚、氯仿及强烈的胍类RNase的特异抑制剂

RNasin（酸性蛋白质，能与多种RNase非共价结合形成等摩尔复合物，从而抑制RNase的活力）与DEPC等

β-疏基乙醇（mercaptoethanol）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。

DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。

作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：

1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）剧毒。试剂的联合使用在RNA的制备过程中，RNase抑制剂常常和蛋白质变性剂和阴离子去污剂等物质联用，加强对RNase活力的抑制。盐酸胍或硫氰酸胍溶液是蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白也由于其二级结构被破坏而从核酸上解离下来。同时，RNase活性能被4mol/L硫氰酸胍和β－巯基乙醇等所灭活。总RNA的制备方法

一是用有机溶剂分级提取RNA；二是利用差速离心沉淀将高分子量RNA和其他类型核酸分离开来。

商品化的单相裂解试剂法分离RNA

改进方案以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。位于界面的DNA与蛋白质可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。同时制备的DNA片段约20kb，可作PCR反应的模板，蛋白样品则主要用于WesternBlot。

Trizol试剂（非柱式）

RNaseTrizol试剂protocolInstructionsforRNAisolationHomogenizationOptional：RNAprecipitation，RNAwash，redissolvingtheRNARNAIsolationnotes去除DNA和蛋白质组织或细胞匀浆室温静置，促进核酸与蛋白解离氯仿促进有机相与水相分层，异丙醇沉淀RNADEPC水（焦碳酸二乙酯）溶解RNA,-80℃保存RNA提取步骤：

mRNA的分离纯化mRNA在真核细胞中含量少，种类多，分子量大小不一且核苷酸序列各不相同，长度可从几百碱基到几千碱基不等。除血红蛋白及组蛋白等的mRNA外，绝大多数mRNA在其3´末端带有长短不同的poly（A）尾。依据mRNA的结构特征，利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，从总RNA制品中分离纯化mRNA。oligo（dT）-纤维素柱层析法

回收量可达总RNA的1％～10％，但分离速度较慢、层析柱易阻塞，不适合同时处理多个标本和少量的RNA样本。

oligo（dT）-纤维素柱离心法

通过离心分离柱达到快速提取mRNA的目的，产物具有产量高、质量好的特点。oligo（dT）-纤维素液相结合离心法

从多个或少量RNA样品中分离出RNA。

磁珠分离法联合利用了oligo（dT）与poly（A）的互补配对、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）的结合特异性以及磁性分离原理，可对poly（A）+RNA进行高效、灵敏及快捷的分离。1h内从总RNA总分离得到mRNA。提取的mRNA能用于几乎所有的分子生物学实验，如cDNA合成、PCR分析、Northern杂交和体外翻译等，且其产量比常规方法高出两倍。最大的缺点是它对组织或细胞的最大处理量每次不超过1g（总RNA量为1mg），且磁珠价格昂贵、需要专门的磁性分离架。5´m7GAAAAAAAAAAAA3´3´TTTTTTTTTTTT-Biotin5´+总RNA中