可见分光光度法课件

3—1

概述3—2基本原理3—3紫外-可见分光光度计3—4分析条件的选择3—5应用第三章紫外—可见分光光度法Ultraviolet-Visible

Spectrophotometry3—1概述一、分光光度法用具有连续光谱的光源照射样品，其原子或分子选择某些具有适宜能量的光子后，由基态跃迁至激发态，在相应的位置出现吸收线或吸收带，所形成的光谱成为吸收光谱。依次测定样品的吸光度随波长（或相应单位）的变化，所记录的吸光度-波长曲线，称为吸收曲线。利用物质的吸收光谱进行定性、定量以及结构分析的方法称为分光光度法。3—1概述二、分类：1、可见分光光度法（400—800nm，可见光区）具有长共轭结构的有机物分子或有色无机物分子外层价电子以量子化的形式吸收特定能量（400—800nm），由基态跃迁至激发态，所形成的电子吸收光谱。在此过程中伴随分子的振动能级跃迁（带状光谱）。用此吸收光谱进行定性、定量及结构解析的方法称为可见分光光度法。2、紫外分光光度法（200—400nm，近紫外区）具有共轭体系的有机化合物及芳香族化合物以量子化的形式吸收特定能量（200—400nm），由基态跃迁至激发态，所形成的电子吸收光谱。在此过程中伴随分子的振动能级跃迁（带状光谱）。用此吸收光谱进行定性、定量及结构解析的方法称为紫外分光光度法。3、红外分光光度法（0.76—500μm，中红外区）分子振动转动光谱，主要用于有机化合物的定性分析三、紫外—可见分光光度法的特点：1、可见分光光度法用于有色或是经显色后生成有色物质的测定；紫外分光光度法，波长范围200—400nm，对有机物结构分析的用处最大。共轭体系及芳香族化合物在此区域内有吸收的、无色或近无色物质是紫外光谱讨论的主要对象。（UV-Vis可用于鉴定有机和无机物质）2、紫外-可见分光光度法，其单色光谱带宽度较窄，一般不超过3

nm。3、该法不仅能鉴定物质及测定含量，还可与其它方法配合，研究物质组成、推断有机化合物的分子结构。4．测定微量组分灵敏度可达10-4~10-7g/mL，准确度一般0.5%或0.2%。3-1概述四物质对光的选择性吸收1、光光是一种人类眼睛可以见到的电磁波（可见光），是电磁辐射的一部分。3-1概述2、物质对光的选择性吸收光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为激发态，只有当辐射能量（h）与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差（E）相等时才能被吸收。M（基态）+h

M*（激发态）物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生的。若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。四、物质对光的选择性吸收2、物质对光的选择性吸收1）物质对光呈现选择吸收的原因：单一吸光物质的分子或离子只有有限数量的量子化能级的缘故。2）选择吸收的性质：反映了分子内部结构的差异，各物质分子能级千差万别，内部各能级间的间隔也不相同。3）形成吸收带：电子跃迁时不可避免要同时发生振动能级和转动能级的跃迁。四、物质对光的选择性吸收3—2

UV-Vis基本原理一、UV-Vis光谱的产生二、UV-Vis光谱的电子跃迁类型三、UV-Vis术语四、UV-Vis吸收带及其特征（1）R带[来自德文Radikalartig(基团)]（2）K带[来自德文Konjugierte(共轭)]（3）B带[来自德文Benzienoid(苯系)]和E带[来自德文Ethylenic(乙烯型)]五、UV-Vis吸收光谱与分子结构的关系六、Lambert-Beer定律

一、UV-Vis光谱的产生分子受电磁波辐射、吸收能量后其能量变化：E

=

E振

+

E转

+

E电子则分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序：E电子>E振>E转UV-Vis光谱是电子光谱、分子光谱、吸收光谱、带状光谱UV-Vis光谱是讨论分子中价电子在不同的分子轨道之间跃迁的能级关系1、分子中价电子的类型参与成键的、*；、*电子未参与成键而仍处于原子轨道中的n电子二、UV-Vis光谱的电子跃迁类型能量大小：σ→σ*>

n→σ*>

π→π*>

n→π*ns

pp**sEl/nm200300400n-p*p-p*s-s*s-p*n-s*p-s*分子中价电子能级及跃迁示意图2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型=

hc电子能级间隔越小，跃迁时吸收光子的能量越小、波长越长、波数越小、频率越低1）σ→σ*的跃迁发生在含有单键的饱和有机化合物，处于σ成键轨道上的电子吸收适当的能量后，可以将σ电子激发到σ*反键轨道上，从而产生σ→σ*的跃迁。分子中σ键比较牢固，跃迁需要能量较高，吸收峰的波长一般都小于150nm，处于远紫外区。在200～400nm范围内没有吸收。饱和烃化合物的σ→σ*跃迁出现在远紫外区2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型2）π→π*跃迁特征：→*跃迁吸光系数值大（>104，强吸收）所需激发能量比σ→σ*要低孤立的π→π*吸收峰的波长在200nm附近，分子中若含有共轭双键，使π→π*跃迁所需能量降低，共轭系统越长，越向长波方向移动，且吸收增强。例：乙烯：λmax

165，

10000；丁二烯：λmax

217，

21000对应化合物：含有不饱和基团有机化合物C=C、C=N、C=O、CC等2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型π→π*跃迁一般出现在近紫外区3）n→π*跃迁对应化合物：含有杂原子不饱和基团C=O、C=N、—N=N—等化合物，特征：n→*跃迁吸光系数值非常小：

10—100，弱吸收最大吸收波长处于较长范围：200-400nm吸收峰一般出现在近紫外区伴随有→*跃迁2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型4）n→σ*的跃迁对应化合物：含杂原子饱和基团—OH、—NH2、—X、—S等的化合物特征：n→*跃迁需要能量比σ→σ*小。n→*跃迁吸光波长在200nm左右。为末端吸收2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型5）总结：化合物分子外层价电子可能产生的主要类型，也可归成两大类：N→V跃迁：由成键轨道向反键轨道跃迁包括π→π*和σ→σ*

N→Q跃迁：由非键轨道向反键轨道跃迁包括n→σ*和n→π*2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型5）总结：紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁

π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收（

σ→σ*、n→σ*）电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系：A、根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；B、根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型A、n→π*产生的吸收峰，ε很小；

π→π*产生的吸收峰，ε很大。

B、根据溶剂极性不同来判断：

极性增加，n→π*产生的吸收峰短移；

π→π*产生的吸收峰长移。2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型6）如何区别跃迁类型1、生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：含有n→π*跃迁和π→π*跃迁的不饱和基团注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团分别所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强。三、UV

-Vis术语2、助色团：本身无近紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强（εmax↑），

同时使吸收峰向长波长（λmax↑）方向移动的基团。特点：1）含有n电子的杂原子饱和基团，如：2）当它们与发色团相连时，能使该发色团的吸收峰向长波长方向移动，并使吸收强度增强的基团，例：三、UV

-Vis术语3、红移和蓝移红移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后，吸收峰（max）位置向长波方向的移动的现象，叫红移（长移）蓝移：由于化合物结构变化（共轭和/或助色团取代基减少）或采用不同溶剂后，吸收峰（max）位置向短波方向移动的现象，叫蓝移（紫移，短移）三、UV

-Vis术语4、增色效应和减色效应由于化合物结构改变或其他原因，吸收强度（max）：（1）增强的效应，叫增色效应，也叫浓色效应。（2）减小的效应，叫减色效应，也叫减色效应。5、强吸收和弱吸收根据摩尔吸光系数：εmax>104→强吸收εmax<102→弱吸收三、UV

-Vis术语1）将不同波长的单色光依次通过待测溶液，测量溶液的吸光度A。2）以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸收曲线，或称吸收光谱。3）曲线上吸光度最大处的地方叫吸收峰，对应波长为最大吸收波长，max。4）峰与峰之间的部位叫谷，对应波长为最小吸收波长，min。5）有的吸收峰较弱或者两峰很接近不容易呈现出完整的吸收峰，而在一个吸收峰旁产生一个曲折，称为肩峰，sh。6、吸收光谱（吸收曲线）横坐标——波长λ，以nm表示。纵坐标——吸收强度，以A（吸光度）表示。

三、UV

-Vis术语说明：在识别谱图时，以峰顶对应的最大吸收波长λmax和最大摩尔吸收系数εmax为准。有机化合物UV吸收的λmax和εmax在不同溶剂中略有差异。因此，有机物的UV吸收谱图应标明所使用的溶剂。吸收光谱特征：定性依据1）吸收峰→λmax2）吸收谷→λmin3）肩峰→λsh4）末端吸收一般，max是定性鉴别物质的基础。不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。四、吸收带类型1、R带[来自德文radikal（基团）]由含杂原子的不饱和基团的n→π*跃迁产生代表基团：C＝O、C＝N、—N＝N—、—NO2特征：E小，λmax250—500nm，εmax<

100，测定n→π*跃迁，要配成浓溶液溶剂极性↑，λmax↓，蓝移（短移），判断n→π*跃迁的存在；有强吸收峰在其附近，R带有时长移，有时被掩盖。吸收带是说明吸收峰在紫外-可见光谱中的位置，与化合物的结构有关。根据电子和轨道类型，可以分为6类：R带举例：四、吸收带类型2、K带[来自德文Konjugierte(共轭)]起源：由π-π*跃迁引起。特指共轭体系的π-π*跃迁。

K带是最重要的UV吸收带之一，共轭双烯、α,β－不饱和醛、酮，芳香族醛、酮以及被发色团取代的苯（如苯乙烯）等，都有K带吸收。例如：特点：1）λmax>200nm，εmax＞10000；共轭链增长，λmax红移，εmax2）溶剂极性↑时，λmax红移3）用K带可判断共轭体系的存在情况四、吸收带类型3、B带和E带起源：均由苯环的π-π＊跃迁引起。是芳香族（包括杂芳香族）化合物的UV特征吸收。特点：1）蒸气状态有精细结构

(苯的B带在230－270nm)在极性溶液中，B带为宽峰，重心在256

nm，εmax偏低，200＜ε＜3000(苯的ε为215)当苯环被取代时，精细结构也会消失。不仅苯环有精细结构，同系物也有，B带精细结构对鉴定芳香化合物是一个有用特征。B—德文Benzenoid（苯系）E—德文Ethylenic（乙烯型）四、吸收带类型2）E1带特强，

λmax180

nm左右(εmax>10000)；

E2带中等强度，λmax

>

200

nm(2000＜εmax

＜10000)3）苯环上引入取代基时，E2红移，但一般不超过210

nm。如果苯环上有发色团，并形成共轭，E2带红移超过210

nm，将衍变为K带。总结：苯环的吸收带包括B带、E带和K带四、吸收带类型4、举例四、吸收带类型l450)B带：max282nm(e4、举例四、吸收带类型（1）饱和化合物1）饱和烷烃*跃迁（<150nm），远紫外区2）含杂原子（O、N、S、X等）的饱和化合物*跃迁、n*跃迁，一般<

200nm，末端吸收注意：溶剂末端吸收的影响1、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物在紫外光区的吸收特性，取决于分子可能发生的电子跃迁类型及分子结构对这种跃迁的影响。五、UV-Vis吸收光谱与分子结构的关系（3）共轭烯烃含—C=C—C=C—基团的化合物，

π-π＊跃迁，吸收带为K带特点：①λmax210－270nm，εmax＞10000（4）,β-不饱和羰基化合物含—C=C—C=O基团的化合物π-π＊跃迁（200—260

nm，强吸收)，吸收带为K带；n-π＊跃迁（310—350nm，弱吸收)，吸收带为R带；（2）只含一个不饱和键的化合物1）不饱和烃*跃迁，*跃迁（~200nm）2）C=O、C=Nn*跃迁，*跃迁（<200nm，强吸收）

n*跃迁（~280nm）

（1）溶剂效应A、对λmax影响：

n-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移（n电子与极性溶剂形成氢键，降低能量多）

π-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↑红移（极性：激发态>基态）2、影响吸收带位置的因素五、UV-Vis吸收光谱与分子结构的关系B、对吸收光谱精细结构影响

溶剂极性↑，苯环精细结构消失所以，测定溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长<

λmax（1）溶剂效应（4）体系pH值影响：影响物质存在型体，影响吸收波长例：苯酚酸性溶液：λmax

211，270

nm碱性溶液：λmax

235，287

nm（2）位阻影响：位阻越大，λmax、max均减小。例：顺式二苯乙烯：λmax

280

nm，max

10500反式二苯乙烯：λmax

295

nm，max

29000（3）跨环效应六、光吸收定律1、Lambert-Beer定律分光光度法基本定律，分光光度法分析的依据和基础。（1）几个概念及有关公式1）光强度Iv：国际基本单位cd（I：透射光强，Io：入射光强）2）透光率T：无单位

3）百分透光率T%:无单位4）吸光度A：无单位（在溶液的配制中最好使其在0.2—0.7）

A，溶液对光的吸收越（2）Lambert-Beer定律1）Lambert定律即

A∝

l2）Beer定律即A∝

c物理意义：若溶液的浓度一定，则吸光度与液层厚度l成正比物理意义：若溶液的液层厚度l一定，则吸光度与浓度c成正比3）光吸收定律：Lambert-Beer定律数学表达式：（E：吸光系数，溶液厚度l，单位cm）A：讨论1）公式的物理意义：当一束平行单色光通过均匀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质的浓度和液层厚度成正比关系。2）公式成立条件：A：稀的均匀溶液；B：单色光（同一物质对不同波长的光吸收系数值不等）；C：平行光3）该定律适用于固体、液体和气体样品A：讨论4）在同一波长下，各组分吸光度具有加和性（多组分测定）。在多组分体系中，如果共存物质间不存在相互作用，即不因共存物的存在而改变每种物质本身的吸光系数，溶液的总吸光度等于各组分吸光度之和，即：A总＝A1+A2+······+An吸光度的加和性是进行混合组分光度测定的基础

1）A=

lc

c：mol/L（摩尔浓度）；

（摩尔吸光系数）：Lmol-1cm-1

2）A=

lcc：g/100mL（质量百分浓度）；

（百分吸光系数/比吸光系数）：100mLg-1cm-1

E1%1cmE1%1cmB、吸光度A的表达式吸光度A随吸光物质浓度c表达不同有不同表达方式（3）吸光系数1）吸光系数的物理意义单位浓度、单位厚度的吸光度讨论：A、E

=

f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定时，E

=

f（λ）表明物质对某一特定波长光的吸收能力

是物质特定条件下的特征常数B、不同物质在同一波长下E

可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E

一般不同C、

E↑，物质对光吸收能力↑，定量测定灵敏度↑→定性分析的依据和定量分析灵敏度的估量A、摩尔吸光系数（）：表示溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸光度。强吸收（

ε>104）中强吸收（104

>

ε>

102）弱吸收（ε

<102）

B、百分吸光系数（）：表示溶液浓度为1g/100mL，液层厚度为1cm时的吸光度。（我国现行药典均采用）

E1%1cm2）吸光系数的表达方式及换算关系M=

10×E1%1cmC、换算关系附加：在分光光度法中用来估量定量分析灵敏度的方法除了摩尔吸光系数和百分吸光系数外，还有桑德尔灵敏度

S=M/(g/cm2)。则：摩尔吸光系数、百分吸光系数越大，表示物质对某波长的吸光能力越强，但与精密度无关。2、光度法的误差引起误差的主要因素：（1）偏离Beer定律（稀溶液、单色光）的因素（光吸收定律的偏离主要原因）1）化学因素：可控2）光学因素A非单色光B杂散光C散射光和反射光D非平行光（2）透光率测量误差A：依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线，称为工作曲线B：偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面：

1、化学因素

2、光学因素（1）偏离Beer定律的因素1）化学因素Beer定律适用的一个前提：稀溶液溶液中溶质浓度较高时，吸光物质发生解离、缔合、溶剂化等现象，即物质的存在形式发生变化。结果，使吸光物质对光吸收的选择性和吸光强度也发生相应的变化结论：Beer定律只适用于稀溶液，C

≤

0.01M2）光学因素引起的偏离A非单色光引起的偏离B杂散光引起的偏离C散射光和反射光引起的偏离D非平行光引起的偏离照射物质的光经单色器分光后

并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度，为复合光。可以使吸光系数变值而偏离Beer定律。其主要原因是由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数。2）光学因素A非单色光的影响

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光A非单色光的影响设被测物质对波长1和2两种光的吸收系数为E1和E2。测定时，两种光各以强度为I01与I02同时入射试样。则：A非单色光的影响讨论：入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状选择测定波长定量的原则：选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑）选λmax作为测定波长（ΔE↓，S↑且成线性），曲线较为平坦。同时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。B杂散光的影响a：杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远b：杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成c：杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值d：影响：正偏离或负偏离C反射光和散射光的影响a：反射光和散射光均是入射光谱带宽度内的光，直接对T产生影响b：散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除D非平行光的影响使光程l↑，A↑，吸收光谱变形测量误差和透光率的关系二、仪器测量误差（相对误差）1、原因：光电管灵敏性差、光源不稳定及读数不准。2、透光率误差T引起浓度误差c：3、透光率65%—20%，A为0.2—0.7时，浓度相对误差较小。A=0.434T=36.8%3—3紫外－可见分光光度计一、主要部件以及光路图光源

单色器

吸收池检测器信号显示系统钨灯或卤钨灯：可见光源340—2500nm氢灯或氘灯：紫外光源160—375nm(光源用石英窗或石英灯管作成)一、主要部件以及光路图1、光源：提供激发能，使待测分子产生吸收理想的光源能够提供连续辐射，

光的强度必须稳定且足够大。氘灯的光强度和使用寿命比氢灯大2～3倍2、单色器：包括入射狭缝、准直镜、色散元件、物镜、出射狭缝色散元件：棱镜、光栅棱镜：对不同波长的光折射率不同，分出光波长不等距玻璃棱镜：用于可见光部分360—1100nm石英棱镜：用于紫外光部分190—400nm光栅：衍射和干涉，分出光波长等距，常用用途：将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出单色光一、主要部件以及光路图狭缝宽度直接影响单色光质量定量分析：较大狭缝宽度，光通量定性分析：较小狭缝宽度，光的单色性一、主要部件以及光路图3、吸收池：用来盛待测试液按材料可分为：光学玻璃吸收池：吸收紫外光，只适用于可见光石英吸收池：不吸收紫外光，适用于紫外和可见光注意事项：保持吸收池透光面的光洁度样品池和参比池的匹配性（厚度一致、透光率之差<0.5%）4、检测器：将光信号转变为电信号的装置光电池光电管（722型）光电倍增管（目前常用）二极管阵列检测器（DAD检测器）5、信号处理和显示系统一、主要部件以及光路图微安表电位计检流计数字电压表（722型）毫伏计二、类型1、单光束分光光度计特点：A：从光源到检测池只有一束单色光B：使用时来回拉动吸收池→移动误差C：对光源要求高D：比色池配对E：适合在给定波长处测量吸光度或透光率722型分光光度计属单波长、单光束直读式分光光度计要求光源必须稳定2、双光束分光光度计

二、类型特点：A：单色光被旋转扇面镜分成交替的两束光，分别通过样品池和参考池B：不用拉动吸收池，可以减小移动误差B：对光源要求不高C：可以自动扫描吸收光谱二、类型3、双波长分光光度计特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差具有两个并列的单色器适合测定多组分混合样品单波长分光光度计与双波长分光光度计的主要区别在于单色器的个数三、光学性能1、波长范围：195—820nm2、波长准确度：仪器显示的波长数值与单色光的实际波长值之间的误差0.5nm3、波长重现性：重复使用同一波长，单色光实际波长的波动值：0.5nm4、透光率测量范围：仪器透光率范围：0-150%（T）5、吸光度测量范围：-0.1730—+2.00（A）6、光度准确度：透光率测量值的误差，透光率满量程误差：0.5%7、光度重复性：同样情况下重复测量透光率的变动性：0.5%8、分辨率：单色器分辨两条靠近谱线的能力。9、杂散光一、检测波长的选择吸收最大，干扰最小选择测量条件，需要从灵敏度、准确度和选择性方面考虑二、测定用溶剂的选择易溶解样品并不与样品发生作用，且在测定波长区间内吸收小，无吸收。3-4

UV-Vis分析条件的选择选A

=

0.2~0.7四、吸光度读数范围的选择三、参比溶液的选择注：采用空白对比，消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰3-4

UV-Vis分析条件的选择溶剂参比试剂参比试样参比比色法是对于能吸收可见光的有色溶液的测定方法，通常也称为可见分光光度法。（灵敏度高、简便）在利用光度法进行样品的定量分析时，由于许多简单的无机物和有机化合物的摩尔吸光系数ε很小，不能直接测定样品含量，因此首先要将样品中被测定组分定量的转变成有吸光能力的有色化合物。五、显色反应与显色条件的选择3-4

UV-Vis分析条件的选择(1)几个定义1）显色反应：将试样中被测组分转化成有色化合物的反应。2）显色剂：与被测组分反应生成有色化合物的试剂。显色剂类型：A：无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等B：有机显色剂：如三苯甲烷类、偶氮类1、显色反应在分析工作中，要选择合适的显色反应,并严格控制反应的条件。（2）显色反应类型1）配位反应（主要的显色反应）2）氧化还原反应（3）对显色反应的要求1）灵敏度高（反应产物摩尔吸光系数足够大）2）被测物质和生成的有色物质之间有明确的定量关系3）反应产物稳定性好4）选择性好5）显色剂在测定波长无明显吸收，与有色物最大吸收波长之差（对比度），应满足>

60

nm。2、显色条件的选择（1）显色剂的用量（要求显色剂过量）AC显色剂（2）溶液酸碱度ApH（3）显色时间At（4）温度AT（5）溶剂：直接影响被测组分对光的吸收（6）干扰的消除(均需通过实验绘制相关曲线加以确定)3、干扰的消除（1）干扰物质的影响：1）干扰物质本身有颜色。2）干扰物质本身无色，但与显色剂形成有色物质。3）在显色条件下，干扰物质水解，析出沉淀使溶液组分浑浊导致无法测定。4）与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物，使显色反应不能进行完全。（2）消除干扰的方法1）控制酸度2）选择合适的掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。3）利用生成惰性配合物4）选择适当的测量波长5）选择适宜的空白溶液溶剂空白、试剂空白、试样空白等6）分离3—5

UV-Vis的应用一、定性鉴别（比较法）1、对比吸收光谱的一致性2、对比吸收光谱的特征数据3、对比吸光度比值二、纯度检查和杂质限量测定1、纯度检查2、杂质限量测定

三、定量分析1、单组分的定量方法2、多组分的定量方法

四、结构分析一、定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱具有特征性吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数1、对比吸收光谱的一致性同一测定条件（同一溶剂、相同浓度）下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较注：只有在光谱曲线完全一致的情况下才有可能是同一物质；同一物质，在相同的测定条件下光谱应该完全一致。一、定性鉴别2、对比吸收光谱的特征值一、定性鉴别3、对比吸光度或吸光系数的比值例：一、定性鉴别二、纯度检查和杂质限量测定1、纯度检查（杂质检查）（1）峰位不重叠：找λ

→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量例：乙醇和环己烷中苯的检查（256nm）（2）峰位重叠：A：主成分强吸收，杂质无吸收/弱吸收→与纯品比较，E↓B：杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形2、杂质限量的测定例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算在HCL溶液（0.05mol/L）中肾上腺素和肾上腺酮有显著不同，在λ310nm下，肾上腺酮有吸收，而肾上腺素无吸收，故利用310nm测定肾上腺酮的含量。（已知：在HCl溶液中样品含量2mg/mL，规定A310

≤

0.05）则杂质限量：二、纯度检查和杂质限量测定E=435三、定量分析1、单组分的定量方法（1）吸光系数法（2）标准曲线法（3）标准对照法：外标一点法定量依据：A

=

ECl（1）吸光系数法（绝对法）依据：比尔定律：AC1、单组分的定量方法练习1：维生素B12

的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12

溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度1、单组分的定量方法练习2：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100mL。精密吸取10.00mL，置100mL容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？（维生素B12

的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207）1、单组分的定量方法练习31、单组分的定量方法A、取系列浓度标准溶液，测定吸光度A。以浓度C为横坐标，相应的A为纵坐标，绘制标准曲线。或根据二者的数值求出回归方程A

=

aC

+

bB、在相同条件下测定供试液的A，从标准曲线或回归方程求出被测组分的浓度。维生素B12的标准曲线

C、制备一条标曲至少需要5—7个点（2）标准曲线法（工作曲线法、校正曲线法）1、单组分的定量方法0.710

mg/25mL芦丁含量测定（3）标准对照法：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时