手性色谱分析

关于手性色谱分析2023/7/1第1页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性的概念：一种镜像反射的对称性MirrorImageMirrorImage第2页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性分子：组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体。分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手性结构。根据对偏振光的作用不同可分为R、S体，两者的等量混合物称之为消旋体。

第3页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性异构体在药理学效应上的差异Pfeiffer规则：对映异构体之间的生物活性存在着差异；不同的对映体之间活性的差异是不同的；当手性药物的有效剂量越低，即药效强度越高时，则对映体之间的药理作用的差别越大。外消旋体和其两种单一对映体是不同的3种实体！第4页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1对映体与生物大分子的三点作用手性分子的a、b、c三个基团与受体分子的活性作用点、、结合，是高活性对映体（优映体）。手性分子的a、b、c三个基团中只有a和b与受体分子的活性作用点和结合，是低活性对映体（劣映体）。第5页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1

在未研究清楚两种单一对映体之间的生物学差异时，以消旋体给药往往会影响药物质量，甚至会严重损害人体健康。“反应停”(Thalidomide)作为人工合成药，当时投入使用时是两种对映体的混合物。

第6页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1

反应停：五十年恩怨第7页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性药物的现状临床药物1850种天然和半合成药物523种化学合成药物1327种非手性6种手性517种非手性799种手性528种以单个对映体给药509种以外消旋体给药8种以单个对映体给药61种以外消旋体给药467种第8页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1发展趋势：

劣映体本身或其代谢物产生毒副作用，不再使用外消旋体。外消旋体转换成单一对映体，不仅提高质量，还延长药物寿命。

如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强，左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的一半。第9页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性拆分（Chiralresolution）对映体除了偏振光的偏转方向不同外，其它理化性质完全相同，因而分离难度大。手性色谱拆分方法：创造（或引入）手性环境，构造非对映异构体，使药物对映体间呈现理化特性的差异，从而实现药物对映体的色谱分离。.第10页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1含多个手性碳原子化合物，分子中所含手性碳越多，对映异构体的数目越多。对映体对映体非对映异构体第11页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性高效液相色谱法（ChiralHPLC)

手性衍生化试剂法（CDR）（分析物）手性固定相法（CSP）（固定相）手性流动相添加法（CMP）（流动相）第12页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性试剂衍生化法（CDR）原理：光学活性药物与有高光学纯度的手性试剂于柱前衍生化，在药物对映体中引入另外一个手性，形成非对映异构体，再以HPLC分析。第13页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性反应注意事项手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好：异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC）类：氨基酸羧酸衍生物：胺类、醇类胺类：羧基化合物。手性待测物必须具备反应活性基团，如胺基（-NH2），醇基（-OH），羧基（-COOH），以保证与CDR反应完全；生成的非对映体光学稳定，柱效要高，能有效检测。第14页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC）类常用试剂有苯乙基异氰酸酯（PEIC）、2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC）。与大多数醇类和胺类化合物反应，形成相应氨基甲酸酯或脲的非对映异构体。广泛应用于氨基酸及其衍生物、麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等药物的分离分析。第15页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1GITC衍生化分离胺类对映异构体反应原理

在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二氯甲烷或DMF中进行。第16页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1色谱分离和前处理条件优化流动相组成和流动相pH对拆分的影响（1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加；（2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。衍生化时间及GITC用量的优化

（1）反应时间：10min~30min（2）用量：过量两倍

第17页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性拆分结果色谱条件：C18色谱柱，流动相：甲醇∶1%三乙基乙二氨四乙酸TEAA缓冲（pH=5.5），检测波长254nm；1ml/min。前处理：药物溶于含三乙胺乙腈水溶液，取50μl该溶液，加入50μl含2g/LGITC的乙腈溶液，混合均匀后室温下放置10min~30min，进样分析。第18页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1拉贝洛尔的GITC衍生化第19页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1第20页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1不同结构的药物衍生化策略胺基类手性药物：运用异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯（IC）类、手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化为酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲和磺酰胺。羧基类手性药物：运用手性胺类衍生化试剂，将其衍生化为酯和酰胺。醇类手性药物：运用手性酰氯、磺酰氯类试剂，将其衍生化成酯。烯类手性药物：衍生化成水性铂复合物。第21页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性固定相法（CSP）原理：将手性试剂化学键合到固定相上与药物对映体反应形成暂时的非对映体对复合物，这种固定相称作CSP。在CSP表面所形成的非对映体对，可根据其稳定常数不同而获得分离。（三点结合模型）第22页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1●对映体和手性固定相之间，至少需要三个同时发生的分子间相互作用力起作用，而其中至少有一个必须是立体化学相互作用。●手性选择剂与对映体中的一种进入一个与立体相关的三点相互作用的稳定状态，而另一对映体则只能两点作用形成不稳定状态。●这种稳定性相差越大，则相互分离的可能性就越大。“三点相互作用”Y为S性手性选择剂，X为外消旋体第23页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性固定相吸附型电荷转移型蛋白质类环糊精类多糖衍生物反相、防有机溶剂正相、防水正、反相均可第24页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1蛋白质类手性固定相

将蛋白质固定到硅胶上，利用蛋白质分子结构中的L-氨基酸提供手性作用位点与手性药物对映体产生不同的氢键作用、静电作用、疏水作用、离子对作用等达到手性拆分。常用流动相为磷酸盐缓冲液（pH4~7），流动相中可加入不超过5%有机溶剂。第25页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1分类白蛋白柱（HSA、BSA）糖蛋白柱：α1-酸糖蛋白柱（α1-

AGP

）酶类第26页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1α1-酸糖蛋白柱拆分西酞普兰对映异构体色谱柱为Chiral-AGP柱（150mm×4.0mm，5μm）柱温为25℃；流动相为50mmol/L醋酸铵缓冲液（乙酸调pH至4.1），流速0.8ml/min；检测波长为240nm。第27页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1纤维素的单体D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键相连而成的线型聚合物，将羟基衍生化成酯以增强手性识别能力。由于水和卤代烃都能溶解纤维素及其衍生物，故流动相大都为正相色谱系统，使用极性较小的非卤代烃有机溶剂。多糖及其衍生物类手性固定相第28页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1纤维素固定相手性识别作用手性中心附近带有羰基的外消旋化合物与纤维素衍生物通过偶极－偶极作用，带有羧基、羟基或氨基的外消旋化合物通过氢键发生手性识别作用。

第29页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1直链淀粉是D-葡萄糖以α-1,4-糖苷键相连而成的线型聚合物，和纤维素的手性识别能力的不同，主要在于其葡萄糖单元的构象差异。第30页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1最常用的多糖型手性色谱柱（Daicel，大赛璐

）

淀粉柱：ChiralpakAD、ChiralpakAS、纤维素柱：ChiralcelOD、ChiralcelOJ第31页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1CHIRALPAKAD系列直链淀粉-三[3,5-二甲苯基氨基甲酸酯]衍生物；用于分离胺类、酯类化合物CHIRALPAKAS系列直链淀粉-三[(S)-α-甲苯基氨基甲酸酯]衍生物；适合于分离β-内酰胺类、环氧化物、酸类、杂环类化合物化合物。CHIRALCELOD系列纤维素-三[3,5-二甲苯基氨基甲酸酯]衍生物；适用于分离β-受体阻滞剂、具有相同功能的化合物、类固醇类化合物，如：阿普罗尔、美托洛尔、氧烯洛尔。（芳氧丙醇胺类）CHIRALCELOJ系列纤维素-三[4-甲基苯甲酸酯]衍生物；被用于分离布洛芬、氯胺酮等药物，以及在手性中心含有一个大的取代基的化合物第32页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1ChiralcelOD固定相分离美托洛尔对映体第33页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1Chiralcel®OD-H手性色谱柱（4.6mm×250mm），流动相为正己烷－异丙醇－二乙胺（65∶35∶0.1）；流速为0.5ml/min；紫外检测波长为259nm；柱温为25℃；进样体积为20μl。

第34页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1环糊精类（包容色谱）

D-葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接的环状分子结构，其疏水性内腔的包容作用和腔外上的羟基与药物对映体的氢键作用是手性识别的基础。有α、β、γ三种类型，其中β环糊精及其衍生物应用范围最为广泛。第35页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1环糊精手性固定相改性环糊精键合固定相机械强度差、不能在高压下使用，用氨基、氨基甲酸酯等改性，形成疏水相互作用或π-π相互作用、偶极－偶极叠合作用，扩大了手性拆分的能力，又称多模式手性固定相（multimodalCSP，MMCSP）。

第36页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性流动相添加法（CMPA）将手性试剂加到流动相中，利用下面两种方式实现拆分：①流动相中手性试剂与对映体形成非对映体配合物，在固定相中的保留时间和分配不同而得到拆分；②手性试剂吸附在柱上形成动态的手性固定相，对映异构体与之作用不同而得到拆分。第37页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1环糊精手性固定相与流动相流动相添加环糊精法拆分时，与流动相中环糊精包合越好的对映体，随流动相较快地被洗脱；环糊精固定相拆分时，与固定相中环糊精包合越好的对映体易被固定相所保留，较慢地被洗脱。以环糊精流动相分离对映体的洗脱顺序与环糊精固定相拆分的顺序刚好相反。第38页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1

影响分离的因素

有机溶剂：用量越少，保留时间越长，但是过高，则环糊精溶解度降低，显著影响对映体的分离度。pH值

酸度增大，有利于碱性药物的分离，对于酸性药物影响无规律性。第39页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1分子结构（１）在其手性原子上均具有两个环状取代基或环内含有手性碳原子，而不能拆分的化合物在其手性碳原子上只含有一个环状取代基。（２）空间效应对手性识别的影响更为显著。（３）环糊精浓度增加有利于手性分离，但β-环糊精溶解度受限制。第40页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性流动相HPLC法拆分萘普生对映体

优化的流动相添加剂：(a)

L-脯氨酸、(b)

β-环糊精（β-CD）、(e)羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）(c、d)甲基-β-环糊精（Me-β-CD）

第41页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1

流动相体系：乙醇∶水相（不同手性添加剂，1%三乙胺水溶液，pH为4.4）；HP-β-CD比甲基-β-CD拆分效果好第42页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1色谱分离和前处理条件优化有机相对拆分的影响（1）相比于乙腈，乙醇可以使保留时间缩短；（2）随着乙醇体积分数的逐渐增大，其容量因子呈逐步减小的趋势，分离因子和分离度也减小。

流动相中HP-β-CD浓度的优化

（1）随着HP-β-CD浓度的提高，容量因子迅速降低、分离因子增大。（2）过高时分离因子变化不大，使该条件下的流动相变浑浊。第43页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1流动相pH值的优化三乙胺含量的优化柱温的优化最佳色谱分离条件为：25mol/LHP-β-CD、15%乙醇、体积分数0.5%三乙胺、pH3.5、柱温25℃。第44页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三2023/7/1手性离子对色谱法反离子(R)-B在流动相中处于未电离的形式，样品为酸性外消旋体(R)-HA和(S)-HA，流动相中就能形成低极性不解离的非对映异构体的“离子对”，可以在正相色谱柱上进行分离。用于氨基醇类和胺类药物