巨细胞病毒对造血干细胞增殖和分化情况的影响

巨细胞病毒对造血干细胞增殖和分化情况的影响【摘要】目的探讨人巨细胞病毒(humancytomeglavirus,HCMV)对造血干细胞的增殖和分化情况的影响。方法采用造血干细胞体外培养技术,研究HCMV-AD169株对脐血造血干细胞增殖和分化情况的影响,采用PCR技术检测干细胞中的HCMVDNA.。结果HCMV在体外能明显抑制造血干细胞的增殖和分化,抑制程度随病毒浓度的升高而增大,经PCR检测病毒感染的细胞中有HCMVDNA的存在。结论HCMV-AD169对造血干细胞增殖和分化情况的有抑制作用。

【关键词】巨细胞病毒造血干细胞增殖分化

Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofhumancytomeglavirusonproliferationanddifferentiationofhematopoieticstemcell.MethodsThetechnologyofcellculturewasusedtoobservetheeffectofHCMV-169strainonproliferationanddifferentiationofhematopoieticstemcell,andthetechnologyofpolymerasechainreaction(PCR)wasusedtodetecttheexistenceofHCMVDNAinHSC.ResultsHCMVAD169suppressedtheproliferationanddifferentiationofHSCinadose-dependentmanner.HCMVwassuccessfullydetectedinAD169straincansuppresstheproliferationanddifferentiationofHSC.

Keywords：Cytomeglavirus;Hematopoieticstemcell;Proliferation;Differentiation

人巨细胞病毒(Humancytomeglavirus,HCMV)感染非常普遍,人是HCMV的唯一储存库,HCMV原发感染后以潜伏状态持续存在，在某些特殊条件下可以被激活，而引起造血功能紊乱，表现为骨髓抑制、血小板减少、粒细胞减少、单核细胞增多症、贫血、肝脾肿大和免疫功能紊乱等［1］。我们采用造血干细胞体外培养技术研究HCMV-AD169对脐血造血干细胞的影响,用聚合酶链反应(PCR)法检测细胞内HCMVDNA,以探讨HCMV对造血干细胞的作用。

1材料与方法1材料

脐血标本均来自于附属医院及妇幼保健院，病毒株HCMV-AD169株由湖南师范大学提供，造血干细胞免疫磁珠分离试剂盒购于宁波新芝科技有限公司，DMEM及IMDM培养基购于GIBCOBRL公司。2方法脐血单个核细胞［2］及CD+34细胞的分离

无菌法采集健康新生儿脐血,用DMEM培养液按1:1稀释,混匀后用吸管沿管壁缓慢叠加于淋巴分离液面上,水平离心2000r/min，30min，在上、中层界面处有一白色云雾层狭窄带仔细吸取单个核细胞，用5倍体积的DMEM培养液洗涤,1500r/min离心10min，重复两次。细胞沉淀用DMEM均匀配成单个核细胞悬液并记数。通过造血干细胞免疫磁珠分离系统分离CD+34细胞。感染方式及分组

采用持续性感染方式，即HCMV直接加入到培养体系中混合培养。实验分对照组两组，分别是①空白对照组:不加HCMV病毒液，加入同体积的IMDM；②灭活对照组：加入同体积灭活HCMV病毒液；感染组分3组即1∶10，1∶100，1∶1000；分别直接加入ml的1∶10，1∶100，1∶1000的HCMV-AD169DNA株病毒液与细胞混合培养。细胞培养将上步收集的细胞进行培养，按106/mlCD+34细胞密度培养，1ml体系中含有%胎血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素，IL-3，SCF各100ng/ml，5×10-7/ml氢化可的松，余体积用IMDM补充。培养于24孔板，每孔1ml，37℃培养于50mmol/LCO2及饱和湿度的培养箱中。每3d半量换液1次，在培养5，10，15，20d和30d时，用血细胞记数板分别计数细胞的增殖情况，染色后镜下观察细胞的分化情况。应用PCR技术检测造血干细胞中的HCMV-AD169DNA取上述培养液低速离心沉淀细胞弃上清液，用磷酸盐缓冲液低速离心洗涤2次，再用双蒸水洗1次，弃上清液，以去除细胞外残留病毒，提取DNA按PCR试剂盒说明书进行，在紫外灯下观察，有无特异的阳性扩增带。

统计学分析

各组属数值型资料，应用sas软件方差分析和q检验。

2结果

造血干细胞形态及增殖和分化情况的影响

观察:两对照组中使用的培养体系质量稳定，细胞生长良好，培养21d以后，台盼蓝活体染色细胞存活率98%。病毒感染组正常细胞数目明显减少，并出现形态学异常，经Winght-Giemsa染色，观察可见一些细胞体积增大，包膜不完整，胞核大，折光性强。增殖情况见表1。表1细胞增殖数目的组间比较(略)

干细胞内HCMV-AD169DNA检测

采用普通PCR技术检测5组细胞内HCMV-AD169DNA,在3个滴度病毒感染组均出现特异扩增带,空白对照组和灭活对照组无阳性扩增带。

方差分析：多组间有统计学意义(F=,),两两比较进行q检验:感染组与对照组间、感染组间均有统计学意义()

3讨论

人群中HCMV感染较为常见［3，4］，已有学者研究发现HCMV感染可伴随有血小板和粒细胞减少等造血系统异常的表现［5，6］但并未引起重视，后来一些学者证实，HCMV抑制机体晚期的造血作用，但HCMV是否直接感染早期造血细胞未见报道，本实验前，脐血标本经严格的检测，未检测到HCMV-DNA，本实验采用病毒直接感染细胞的混合培养的方法,用不同浓度的巨细胞病毒HCMV-AD169体外培养感染人脐血造血干细胞，结果显示对脐血造血干细胞的增殖和分化有明显的抑制作用。

实验采用PCR检测技术检测干细胞中的HCMV-DNA的结果在各培养体系中HCMV感染组均能检测到相应的阳性扩增带，表明干细胞可能是HCMV潜伏的最主要细胞之一,HCMV-AD169株能直接感染脐血造血干细胞抑制其增殖和分化,这与临床上出现的造血功能紊乱可能有关。

【参考文献】

［1］CrapnellK，zanjaniED，ChaudhuriA，etvitroinfectionofmegakaryocytesandtheirprecursorsbyhumancytomegalovirus［J］.Blood,2000,95(2):487.

［2］金伯泉.细胞和分子免疫学实验技术［M］.西安：第四军医大学出版社，2002：61.

［3］MintonEJ,TysoeC,SindairJH,etcytomegalovrusinfectionofthemonocyte/macrophagelineageinbonemarrow［J］.JVirol,1994,68:4017.

［4］DejongMD，GalassoGL，GazzardB，etoftheinternationalsymposiumoncytomegalovirus［J］.AntiviralRes,1998,39(3):141.

［5］MizutaniK,AzumaE,KomadaY,etintantilencaseofcytomegalovirusinducedidiopathicthrombocytopenticpururawithpredominantprolifcrationofCD10positivelymphoblastinbonemarrow［J］.ActapaediatrJpn,1995,37:71.

［6］ZHANP,LI