Caspase8、3蛋白在PUVA诱导K562细胞凋亡时的变化

Caspase8、3蛋白在PUVA诱导K562细胞凋亡时的变化

【摘要】目的研究Caspase8、3蛋白在补骨脂素加长波紫外线光化学疗法诱导人白血病K562细胞凋亡时的变化。方法用不同浓度的中药补骨脂中提取的PSO和不同照射时间、波长为360nm的UVA作用于K562细胞，检测细胞凋亡率、在电镜下细胞超微结构改变及Caspase8、3蛋白的表达，用多因素方差分析法对定量资料进行统计分析。结果PSO、UVA照射及PUVA均可使细胞凋亡率增加，后两者上调Caspase8、3蛋白的表达，PUVA的作用显着强于前两者；PUVA处理后的K562细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变。结论PUVA可通过激活Caspase8、3基因诱导K562细胞凋亡。

【关键词】光化学疗法K562细胞凋亡Caspase8Caspase3

Abstract：ObjectiveTostudythechangesofCaspase8andCaspase3proteinsinK562cellsduringapoptosisinducedbypsoralen(PSO)plusultravioletA(UVA)(PUVA).MethodsTheK562cellsweretreatedwithPSOextractedfromChinesemedicinepsoraleafruitsindifferentconcentrationsplusUVA(360nm)indifferentirradiationtimeornot.Apoptosisratios,ultrastructurechangesandexpressionofCaspase8andCaspase3proteinsweredetected.Thefactorialdesignandanalysisofvariancewereusedtoanalyzetheinteractionamongthefactors.ResultsPSO,UVAandPUVAallincreasedtheapoptosisratiosandUVAandPUVAupregulatedtheexpressionofCaspase8andCaspase3proteins,buttheeffectsofPUVAwerethestrongest.TherewereobviousultrastructurechangesinapoptosisaftertreatmentwithPUVA.ConclusionPUVAcaninducetheapoptosisofK562cellsthroughactivatingCaspase8andCaspase3genes.

Keywords：photochemotherapy;K562cell;apoptosis;Caspase8;Caspase3

化疗药物杀伤白血病细胞的主要途径是诱导细胞的凋亡，Caspases(Cysteinylasparatespecificproteinase)是一种特异性蛋白酶，以执行细胞凋亡而受到广泛关注［1~2］。Caspase8和Caspase3均属于该家族的成员，在凋亡过程中发挥重要作用，其中前者被认为是凋亡的启动者，后者被认为是凋亡的执行者［3］。PUVA是补骨脂素(psoralen，PSO)加长波紫外线光化学疗法，目前的研究对象多为人工合成PSO衍生物，我们从中药补骨脂中提取了PSO，研究PUVA在诱导人类白血病细胞K562凋亡时Caspase8、Caspase3蛋白的变化，以进一步了解PUVA诱导白血病细胞凋亡的作用机制。

1材料与方法

细胞株人慢性粒细胞白血病K562细胞由大连医科大学惠赠。常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养。

药品及主要试剂

补骨脂素由大连理工大学及我院共同由纯中药补骨脂中提取和制备。RPMI1640培养液为Gibco产品。小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司产品。HistostainTMPlUsKits免疫细胞化学分析试剂盒购自美国Zymed公司。DAB(3，3’diaminobenzidinetetrahydrochloride)显色试剂盒购自美国VectorLtd公司。Caspase8、Caspase3兔抗人多克隆抗体购自CellScience公司。

仪器和设备

流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司，GLY10型光量子血液平衡治疗仪由徐州华卫医疗设备公司研制。

流式细胞术测定

PUVA后24hK562细胞的凋亡情况取浓度为×105/ml，处于对数生长期的K562细胞5ml，分别加入补骨脂素0，5，10，20，40μl，使其在反应体系中的终浓度分别为0，10，20，40，80mg/L，放入石英比色皿中，在GLY10型光量子血液平衡治疗仪上以1J/m2辐射量边照射边震荡，照射时间分别为0min，5min。处理后各实验组细胞继续培养24h后，收集×105细胞，用PBS洗2次，弃上清，加入100μl碘化丙啶染液，避光反应30min，加入PBS400μl，上机检测，并用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。

透射电镜下观察细胞超微结构特点

收集浓度为×105/ml，经PUVA处理的K562细胞10ml，用PBS清洗2次，转入ml离心管，离心3min，弃上清，缓缓加入%戊二醛2ml，4℃冰箱静置2h以上。磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定，水洗、脱水，浸透、包埋，制定超薄切片，透射电镜下观察。

免疫细胞化学法(ICC)检测

Caspase8、Caspase3蛋白的表达情况细胞处理方法同前，选择PSO浓度为40、80mg/L，UVA照射时间5min组，以及PUVA组进行ICC检测。在处理后0、4、8和12h，以移液器吸取经处理的细胞悬液，注入离心管中离心，弃上清，加1×PBS()混匀清洗，再离心，弃上清混匀后均匀涂片，室温吹干，继而用100%冷丙酮-20℃固定20min，自然晾干，用于ICC分析。ICC分析方法参照试剂盒说明书，抗体的稀释倍数为1：100，PBS代替一抗为阴性对照。

统计学方法

所有实验结果均来自至少3组平行实验。采用多因素方差分析法对定量资料进行统计分析；所有统计计算均用统计软件进行，P＜认为差异有统计学意义。临床军医杂志第36卷

2结果

诱导K562细胞凋亡的作用应用流式细胞仪检测PUVA后24hK562细胞凋亡率，见表1。表1PUVA后24hK562细胞凋亡率

透射电镜下观察PUVA后细胞超微结构的改变

K562细胞出现细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核体积减小，可裂解成一个或数个致密体，可见核小体碎裂，核染色质聚集或边集，部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状，整个细胞可裂解成大小不一凋亡小体。

对Caspase8、Caspase3蛋白的影响

应用ICC法检测Caspase8、Caspase3蛋白的表达情况，Caspase8、Caspase3蛋白定位在细胞质或核上，呈棕黄色颗粒。每张涂片随机选取3个视野，计数100个细胞，计算阳性细胞占计数细胞的百分比，见表2、3，封二图4。表2PUVA后K562细胞Caspase8蛋白的表达表3PUVA后K562细胞Caspase3蛋白的表达

3讨论

过去的研究已经证实PUVA对人类白血病细胞有杀伤作用［4］，在此基础上我们通过流式细胞技术和电镜技术对K562细胞凋亡率及细胞超微结构改变进行了检测和分析，进一步证实PUVA对人类慢性粒细胞白血病K562细胞有明显诱导凋亡的作用，可以说明诱导白血病细胞凋亡是PUVA杀伤人类白血病细胞K562的途径之一。在哺乳动物细胞，Caspase以依赖线粒体和非依赖线粒体两条途径促进细胞凋亡，Caspase8和Caspase3在其中起重要作用。前者是细胞凋亡的启动者，被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活［5］，且可将凋亡信号从非依赖线粒体途径传递到线粒体途径，把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，放大凋亡信号［6］；后者是线粒体—细胞色素C途径、死亡配体和受体途径、颗粒酶B途径的共同通路［7~9］，是细胞凋亡的主要效应因子。

本组结果显示，单纯PSO对K562细胞Caspase8、Caspase3蛋白的影响较小，两个浓度组间没有统计学差异，未见到随着作用时间的延长而出现的作用增强；UVA及PUVA可使K562细胞Caspase8、Caspase3蛋白的表达增强，对前者的作用PUVA要显着强于UVA，但对后者PUVA与UVA组间没有看到明显的差异，PUVA对两者的作用呈一定的时间依赖性，均在作用8h达峰。从研究中我们还发现，PUVA对Caspase8、Caspase3蛋白表达产生明显作用的时间分别为作用8h和4h。理论上，前者是凋亡的启动者，后者是凋亡的执行者，对前者产生影响的时间应该在后者之前，这样的结果或许是因为两者从基因水平转录至蛋白水平所需时间的不同所致。综上所述，我们可以认为诱导细胞凋亡是PUVA杀伤人类白血病细胞K562的途径之一；PUVA在诱导K562细胞凋亡的过程中激活了Caspase8、Caspase3，两者至少需要8h才能在蛋白水平上发挥最大作用。

【参考文献】

［1］Greenpathways:theroadstoruin［J］.Cell,1998,94(6):695-698．

［2］JuoP,KuoCJ,ReynoldsSE,etal.FasactivationoftheP38mitogenactivatedproteinkinasesignallingpathwayrequiresICE/CED3familyproteases［J］.MolCellBiol,1997,17(1):24-35.

［3］TongX,LinS,FujiiM,etal.MolecularmechanismsofechinocysticacidinducedapoptosisinHepG2cells［J］.BiochemBiophysResCommun,2004,321(3):539-546.

［4］陈楠楠，黄世林，张德杰，等.补骨脂素加长波紫外线对人白血病细胞株NB4、HL60、K562作用的研究［J］.中国中医急症,2007,16:444-446.

［5］NagataS.Apoptosisbydeathfactor［J］.Cel1,1997,88(3):355-365．

［6］LiH,ZhuH,XuQ,etofBIDbyCaspase8mediatesthemitochondrialdamageintheFaspathwayofapoptosis［J］.Cell,1998,94(4):491-501.

［7］LiuX,KimCN,YangJ,elal.nductionofapoptoticprogrameincellfreeextracts:requirementfordATPandcytochromeC［J］.Cell,1996,86(1)