生物学案（苏教版）第十单元第6课时基因工程的基本工具和基本操作程序

第6课时基因工程的基本工具和基本操作程序课标要求1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。考点一基因工程的基本操作工具1．基本工程的概念(1)供体：提供________________。(2)操作环境：________。(3)操作水平：________水平。(4)原理：________________________________________________________________________________________________________________________________________。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在__________________________体内的表达。拓展基因工程的理论基础

2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)(2)DNA连接酶(3)载体延伸应用图解限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。考向基因工程的基本工具1．下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是()限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGG注：Y为C或T，R为A或G。A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列2．(多选)第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是()A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有1个游离的磷酸基团C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶3．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是()A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因考点二基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取(1)化学合成法直接人工合成目的基因：一般为比较小的目的基因。(2)基因文库获取目的基因：来源可分为____________文库和________文库。①基因组文库：指含有某种生物体__________基因片段的____________的克隆群体。从基因组文库中筛选某种目的基因，一般采用________________。②cDNA文库：从组织细胞中提取__________，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主，包含着细胞全部________________________克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。2．基因表达载体的构建(1)目的：使目的基因进入________________________________________________。(2)基因表达载体的组成及作用(3)构建过程易错提醒启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物哺乳动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射法处理法受体细胞原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达取卵→将含有目的基因的表达载体注入→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→细胞处于一种容易接受外来DNA的生理状态→基因表达载体导入辨析(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的____________上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的______________________上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入______________，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入__________________。(2)农杆菌特点①能在自然条件下感染___________和________________，而对大多数____________________没有感染能力。②农杆菌细胞内含有__________________，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。4．目的基因及其表达产物的检测鉴定考向基因工程的基本操作程序4．戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣売。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是()A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒C．过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定5．下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是()A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增B．具有启动子，作为多肽链合成的起始信号C．具有标记基因，有利于目的基因的初步检测D．具有目的基因，以获得特定的基因表达产物6．(2021·全国乙，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，上图中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA连接酶连接，上图中______________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能______________；质粒DNA分子上有_____________________，________________________便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是___________________________________________________________________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________________________________________________________________________________________。

考点三PCR技术、电泳鉴定及DNA的粗提取和鉴定1．PCR技术(1)过程变性：94℃条件下受热________后解链为单链↓退火：55℃条件下，________与单链相应互补序列↓结合延伸：72℃条件下在________作用下合成子链思考分析①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成________________的原料，又可为DNA的合成提供________。②引物既可以是DNA单链，也可以为________。细胞内的DNA进行复制时，也需要________，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要________激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加______________________。④PCR扩增过程中的循环图示与规律循环次数123nDNA分子数2含引物A(或B)的DNA分子数1同时含引物A、B的DNA分子数0＝21－2共消耗的引物数量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－2(2)PCR技术和DNA复制的比较(3)DNA的电泳鉴定2．DNA的粗提取和鉴定(1)基本原理①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。②DNA的性质：DNA不溶于________，但某些蛋白质溶于_______；DNA能溶于2mol·L－1的________。③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇____________试剂会呈现蓝色。(2)过程考向一PCR技术及电泳鉴定7．(多选)(2023·江苏南京高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是()A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程8．利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是()A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理B．PCR利用了DNA的热变性原理C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换考向二DNA的粗提取和鉴定9．下列有关“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是()A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取B．选用洋葱作为实验材料时可以使用吸水涨破法破坏细胞C．DNA可溶于蒸馏水，也可溶于2mol/L的NaCl溶液D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色1．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取和鉴定的叙述，错误的是()A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNAD．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热2．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是()A．①＋③ B．①＋②C．③＋② D．③＋④3．(2020·浙江7月选考，24)下列关于基因工程的叙述，正确的是()A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNAD．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置4．(2020·江苏，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种______________酶，它通过识别特定的______________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________________；PCR循环中，升温到94℃是为了获得________________；Taq酶的作用是催化________________。(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。A．5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′B．5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′C．5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′D．5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′5.(2022·江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞质膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是____________________________________________________________________________________________________。(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至mol/L的目的是___________________。PCR扩增时，需在______________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。请完成下表。分步实验目标简易操作、结果、分析PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向)①选择图Ⅱ引物__________；②PCR目的产物约为__________bp确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有HindⅢ＋EcoRV的识别序列，下游含有EcoRV＋BamHⅠ的识别序列③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选填序列编号)检测融合蛋白定位④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明______________________________________________________________(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。一、易错辨析1．限制酶也可以识别和切割RNA()2．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来()3．E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端()4．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物()5．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精()6．在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关()二、填空默写1．(选择性必修3P