基因组学与比较基因组学

关于基因组学与比较基因组学第1页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三什么是基因组，基因组学？基因组（Genome）：是指生物体的单倍体细胞中所有的DNA，包括细胞核内的DNA和各种细胞器中的DNA，是生物体内遗传信息的集合。基因组学（genomics）：是研究并解析生物体整个基因组所有遗传信息的一门学科。第2页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三结构基因组学功能基因组学比较基因组学基因组学的发展：从序列到功能第3页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三结构基因组学结构基因组学：基因组计划基因组作图测定核苷酸序列基因定位第4页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三功能基因组学

功能基因组学：后基因组学（postgenomics)

利用结构基因组学提供的信息和产物，在基因组系统水平上全面分析基因的功能的一门学科。第5页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三比较基因组学

比较基因组学：研究不同物种之间在基因组结构和功能方面的亲源关系及其内在联系的学科。

第6页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三基因组计划的主要任务是获得全基因组序列；现在的测序方法每次只能测800-1000bp，大量的测序片段要拼接；要知道序列在染色体上的位置才能正确拼接，因此需构建基因组图谱。第7页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三教学内容一、高通量DNA序列分析技术二、人类基因组计划三、比较基因组学第8页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三DNA序列分析技术

DNA序列分析鸟枪法测序技术及其改良一、高通量DNA序列分析技术第9页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（一）DNA序列分析技术DNA序列测定：是指DNA一级结构的测定，是在核酸酶学和生物化学的基础上，创立并发展起来的一门重要的DNA技术学。第10页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三DNA序列测定的技术

杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法

DNA芯片法经典方法:

双脱氧链末端终止法(Sanger,1977)DNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技术方法:第11页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。利用双脱氧核苷酸作为链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法。1980年诺贝尔奖金获得者F.Sanger1、双脱氧链末端终止法第12页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（1）Sanger双脱氧链末端终止法测定DNA序列的基本原理：以DNA合成反应为基础，加入ddNTP生成特定末端不同长短的DNA片段；聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子。第13页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

DNA合成反应

第14页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，在DNA合成反应中，加入ddNTP，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5′-P端形成3′、5′-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP。第15页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

ATP、dATP和ddATP的结构ATPdATPddATP第16页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三第17页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三这样以待测序列的DNA为模板，加入引物和4种dNTP（其中一种为α-32P标记），将此反应物分为4等份，每份内加入一定比例的一种ddNTP，如此形成A、T、C、G四个反应体系，最后在各反应体系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。这样各反应体系中即可形成以一种ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段。第18页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三CAGTTemplatePrimerdATPdNTPPolymeraseTerminator第19页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三THEPROCESSTCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGAT第20页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三第21页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

DNA模板ATTGCAGTCGAC

生成的新链TAACGTCAGCTG

T管：

C管：

TAACGTCAGCT

TAACGTCAGC

TAACGT

TAACGTC

TTAAC

G管：

A管：

TAACGTCAGCTGTAACGTCA

TAACGTCAG

TAA

TAACG

TA

第22页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三第23页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三TAACGTCAGCTGTAACGTCAGCTTAACGTCAGCTAACGTCAGTAACGTCATAACGTC

TAACGTTAACGTAACTAATA

T

第24页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（2）双脱氧末端终止法主要步骤

单链DNA模板的制备DNA模板与测序引物退火延伸-终止反应变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射性自显影阅读测序结果第25页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三将DNA克隆到质粒载体将DNA克隆到M13噬菌体载体将DNA克隆到酵母人工染色体——基因组DNA大片段文库PCR双脱氧链末端终止法要求单链作为模板如何得到单链DNA？第26页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三2、DNA测序自动化

DNA测序的自动化是在Sanger的双脱氧链末端终止法的基础上在1987年由美国应用生物系统公司进一步发展起来的激光测序法，其基本原理与末端终止法一样，都是通过ddNTP竞争性的终止新合成的DNA链。第27页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三DNA测序自动化步骤：

4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物电泳分离激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序第28页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA第29页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三THEPROCESSTCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGATC第30页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三第31页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三以荧光化合物标记双脱氧核苷酸的自动测序第32页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（二）鸟枪法测序技术及其改良

基因组的每条染色体长度可达数百万碱基对以上，将链终止法测定的小片段DNA组装成真实的排列顺序是一项浩繁而精细的工作。DNA顺序的组装主要方法：全基因组鸟枪法测序改良鸟枪法：大片段克隆法、靶标鸟枪法第33页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三1、全基因组鸟枪法测序鸟枪法的顺序组装是直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠，然后依次向两侧邻接的序列延伸。第34页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三DNA的鸟枪法测序的主要步骤

第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。第二，高效、大规模的末端测序。第三，序列集合。第四，填补缺口。第35页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三鸟枪法测序示意图第36页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三鸟枪法的优势：

鸟枪法的主要优势在于：测序速度快，并且无须提供相关的遗传图谱和物理图谱。

20世纪90年代末，用鸟枪法在较短时间内成功地完成了流感嗜血杆菌的基因组测序，引发了一场微生物基因组测序的热潮。这些研究项目的实施，表明鸟枪法测序可以组建一条流水工作线，一个科研小组可以分工合作，一部分人专门负责制备DNA，一部分人负责测序和数据分析。经验证明，一个5Mb大小基因组的测序可以在一年内完成。第37页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三鸟枪法的局限：拼接组装困难：对于结构复杂的大基因组而言，鸟枪法的序列组装的起始阶段工作量非常大。。重复序列的存在：在序列组装时可能出现错误连接，使某些片段从原位置跳到另一无关位置。因此，对于缺少重复顺序的小基因组（<5Mb）而言，鸟枪法仍为最佳的选择，但对于大基因组而言，还需要更加有效的策略。第38页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三第39页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三2、改良鸟枪法（1）大片段克隆法：将基因组DNA分解为若干个较大的DNA片段，构建基因组文库；根据克隆插入子两端的DNA序列查找与之连接的克隆建立重叠群；每个克隆可以独立进行鸟枪法测序；依据克隆重叠群进行序列组装这种方法又称为克隆重叠群测序法。第40页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三克隆重叠群第41页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三大片段克隆法第42页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（2）靶标鸟枪法根据染色体上已知基因或遗传标签的位置来确定部分DNA片段的排列顺序，再逐步确定各片段在染色体上的相对位置，是建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”。第43页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三第44页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三教学内容一、高通量DNA序列分析技术二、人类基因组计划三、比较基因组学第45页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三二、人类基因组计划人类基因组计划（Humangenomeproject）于1990年启动，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。第46页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（一）人类基因组计划概述1986年诺贝尔奖获得者R.Dulbecco（杜尔贝科）提出人类基因组计划——测出人类全套基因组的DNA碱基序列（3X109bp）第47页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三1988年美国能源部和国家卫生研究院率先在美国开展人类基因组计划，并经国会批准由政府给予资助。此后，成立了一个国际间的合作机构——人类基因组织(HumanGenomeOrganization)，由多个国家筹集资金和科研力量，积极参加这一国际性研究计划。第48页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三1989年，美国国立卫生研究院成立了人类染色体研究中心，沃森出任第一任主任。第49页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三1990人类基因组计划起动；1995第一个原核生物（细菌）基因组测序完成；1996第一个真核生物（酵母）的基因组测序完成；1998第一个多细胞生物（线虫）的基因组测序完成；2000果蝇和拟南芥的基因组测序完成；人类和水稻的第一张基因组草图完成；2001人类基因组测序（精细图）完成；水稻（籼稻和粳稻）基因组草图完成。2003年4月，人类基因组序列图（完成图）完成。人类基因组计划的进展状况第50页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成第51页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三2000年6月26日，美国总统克林顿(中)、塞莱拉公司董事长兼首席科学家克雷格·文特尔(左)和人类基因组计划首席科学家弗胡西斯·柯林斯(右)在华盛顿白宫参加庆祝人类基因组草图绘制成功。第52页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三人类基因组计划的科学意义（1）确定人类基因组中约数万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。（3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。第53页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（4）研究空间结构对基因调节的作用。（5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，为疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。第54页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三遗传图谱转录图谱0.7cM或kb

序列图谱物理图谱100kbSTSmap遗传图、物理图、转录图、序列图（二）人类基因组计划的工作任务第55页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三1、遗传图遗传图概念：又称连锁图，是指采用遗传学技术构建显示基因或DNA分子标记在基因组上相应位置和遗传距离的图谱。第56页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

遗传作图是将每条染色体上的基因或DNA标记的相对位置经连锁分析确定下来，构成图谱，因此，需借助相应的遗传标记。遗传作图第57页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三遗传图谱的标记是什么呢？标记1标记2标记3染色体上的基因和DNA序列均可作为路标,他们由特定的DNA顺序组成.路标位于染色体上的位置是固定的，不会更改的，从而而提供了作图的依据。第58页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三遗传标记最早的遗传标记——基因第一代遗传标记——限制性片段长度多态性第二代遗传标记——简单序列长度多态性第三代遗传标记——单核苷酸多态性第59页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（1）基因是首先被使用的标记孟德尔→豌豆植株高矮、豌豆的形状等摩尔根—显微镜、肉眼→果蝇躯体颜色、翅膀形状等生化表型→细菌、酵母遗传学研究；人类中如血型系列（ABO）分析、血清蛋白和免疫蛋白第60页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三基因是非常有用的标记，但并不是理想的，基因标记的缺点：1、可用作标记的基因十分有限，许多性状都涉及多基因。2、高等生物基因组中存在大量的基因间隔区，遗传图中留下大片的无标记区段。3.只有部分基因其等位基因成员可以通过常规实验予以区分，因而产生的遗传图是不完整的。第61页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（2）限制性片段长度多态性

（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）最早发现的DNA分子标记：指同一物种的亚种、品系或个体间基因组DNA受到同一种限制性内切酶作用而形成不同的酶切图谱的现象，称为限制性片段长度多态性（RFLP)。第62页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三限制性片段长度多态性是由于基因组DNA某一位点上的变异引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变（原有位点的消失或出现新的酶切位点），致使酶切片段长度随之发生变化而产生。第63页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

RFLP多态性的产生与检测第64页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三RFLP的优点（1）遍布于整个基因组，位置相对固定；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；第65页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三共显性:

两个亲本的性状在子代个体中同时出现，没有显隐关系。第66页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

限制性片段长度多态性的缺点制备可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；DNA需要量大，实验操作较繁锁，检测周期长成本费用也很高；RFLP分子标记分布密度过于稀疏，现已逐步被其他类型分子标记所取代。RFLP是最早发现的分子标记，也被称为第一代分子标记。第67页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三又称串联重复序列，其多态性主要来自重复序列拷贝数的变化，包括小卫星DNA和微卫星DNA。小卫星DNA—由15-65bp的基本单位串联重复而成，长度一般不超过20kb。重复次数（小卫星DNA区的长度）在人群中是高度变异的；按照孟德尔的规律遗传微卫星DNA/简短串联重复（STR、STRP或SSLP），重复单元2-8bp，通常重复10-60次GCTTATATATATATATATATATATATAAGCT（3）简单序列长度多态性第68页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三微卫星序列（SSR）第69页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三如何检测SSR根据简单重复顺序两侧的序列设计引物,经聚丙烯胺凝胶电泳分辩.第70页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

SSR标记的优点（1）在基因组中随机分布，检测的多态性频率高；（2）PCR特异引物，重复性好；（3）共显性，操作相对简单。第71页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

SSR标记的缺点（1）SSR需要测序和设计引物，因而需要大量的人力、物力和时间；（2）另外其种属特异性强，开发所需的费用高昂。

SSLP标记又称为第二代分子标记第72页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三（4）单核苷酸多态性

（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）SNP是指同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差异的现象。其中最少一种在群体中的频率不小于1％；如果出现频率低于1％，则视作点突变。第73页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三人类99．9％的基因密码是相同的，而差异不到0．1％，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础。第74页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于，它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。第75页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三连锁互换定律的基本内容位于同一染色体上的两个或两个以上的基因遗传时，常有连在一起遗传的倾向——连锁；但在配子形成过程中，同源染色体的非姊妹染色单体间发生局部交换的结果导致重组类型的产生——互换（重组）；连锁的频率大于重组的频率。遗传作图——连锁互换分析第76页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三AB

AbaB

ab(25)

(25)(25)

(25)(50)

(0)(0)

(50)(48)

(2)(2)

(48)配子类型(%)独立遗传孟德尔第二定律完全连锁不完全连锁连锁遗传定律ABABabab×第77页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三遗传作图——连锁互换分析基因（遗传标记）在染色体上的位置是相对恒定的，它们之间的重组率也是相对恒定的，不同基因之间的重组率不同。相邻的两个基因（遗传标记）由于重组而分开的概率将低于距离较远的两个，所以重组率的大小可反应它们之间在染色体上距离的远近；因此可通过基因重组率的计算来估算基因（遗传标记）间的遗传距离。第78页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三遗传图距的单位：厘摩（cM）——每单位厘摩为1％重组率如果两个基因间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。计算出不同基因（遗传标记）之间的重组率，就可以构建出显示基因在染色体上相对位置的图——遗传图谱。第79页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三遗传作图的主要方法杂交实验家系分析

第80页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

杂交实验的连锁分析的程序:

选择已知基因型的亲本→设计杂交方案→获得交配的子代→分析其表型及基因型第81页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三

玉米中的连锁遗传

有色饱满

X无色皱缩

CS/CS

cs/cs

↓

测交：F1CS/c

sXcs/cs（双隐性）↓

CS/cs

Cs/cs

cS/cs

cs/cs

有、满有、皱无、满无、皱自由组合预期：1111实验结果：40321491524035

亲组合重组合

96.4%3.6%第82页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三重组率绘制遗传图重组率为测量基因之间相对距离的尺度.第83页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三与经典遗传作图类似，只是统计性状改为DNA分子标记。

程序：选择已知基因型的亲本→设计杂交方案→获得交配的子代→分析其DNA分子标记DNA分子标记遗传图绘制第84页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三物理图概念：采用分子生物学方法直接将基因或DNA分子标记标定在基因组实际位置的图谱。以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，sequence-taggedsite,STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。2、物理图第85页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三STS作图的原理两个STS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，分离的几率越大。两个STS之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它们之间的图距根据它们的分离频率来算。第86页，讲稿共98页，2023年5月2日，星期三STS作图原理图示第87页，讲稿共98页