时间分辨荧光免疫层析技术简介

时间分辨荧光免疫层析技术简介

主要内容免疫层析技术原理1工作问题机解决方案免疫标记材料介绍2时间分辨荧光分析法3应用实例4免疫层析技术原理免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。发展阶段：初期：定性检测新阶段：半定量、定量检测（信号放大、信号转换）设计形式：测向流层析垂直流层析（渗滤法）免疫层析技术原理侧向流层析固定相：固定有检测线和控制线的纤维层析材料（NC膜）流动相：测试液移动：毛细作用结合：游离态待测物在固相捕获线处发生特异性免疫反应图1典型侧向流免疫层析试纸条构造（来源：MerckEstapor）免疫层析技术原理反应模式：竞争法（小分子如药物、毒素）夹心法（大分子如激素、菌体）图2免疫层析竞争法及夹心法反应原理图（来源：网络）免疫层析标记材料标记材料分类：胶体金胶体金标记方法简单金颗粒粒径1~100nm，与不同分子量的蛋白质结合比例不同特异性强，适用范围广，可做多合一检测物理吸附的结合方式易受pH值、离子强度等的影响结果可视（消线法、比色法目测判读），对照比色卡或借助仪器可实现半定量检测图3

胶体金检测试纸卡及读数仪（来源：勤邦生物）纳米微粒二氧化硅微球粒径均一100nm~10μm理化性质稳定、抗紫外线、球形性好密度较大、有一定本底、易吸附色素离子乳胶微球粒径均一理化性质较稳定、球形性好密度稍大于水上述两种微球可制备成核-壳式结构，内部包埋染料、荧光物质或磁性物质，分别制成彩色荧光微球、有机荧光微球、时间分辨荧光微球、上转换磷光微球、超顺磁性微球等，其相应的生物-光电/磁信号转换-放大功能，为定量检测提供了依据；其外部可增加修饰不同密度、不同种类的官能团，通过化学偶联的方式结合蛋白等物质，从而使标记物更加稳定、检测灵敏度提升。量子点（见后文）图4400x放大的微米级聚苯乙烯微球（来源：Bangslabs）荧光(Fluorescence)：一种光致冷发光现象。荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量（发射光波长>入射光波长），停止入射光后发光现象也随即消失，具有这种性质的出射光就被称之为荧光。发射光谱(Emissionspectrum)：固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱(Exactionspectrum)：固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。斯托克斯位移(Stokesshift)：通常情况下荧光光谱较相应的吸收光谱红移，可用相同电子跃迁在吸收光谱和发射光谱中最强波长间的差值表示。荧光材料图5

荧光光谱图示例（来源：网络）荧光效率(Fluorescenceefficiency)：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率，可用荧光强度占激发光强度的百分比表示。荧光寿命(Fluorescencelifetime)：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的时间。荧光猝灭(Fluorescencequenching)：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、某些硝基化合物、重氮化合物、重金属、卤素阴离子等）的作用下，激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射，从而导致荧光减弱甚至消退的现象。引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，常用于消除不需要的荧光。荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）AlexaFluor、CFDye等新一代荧光染料系列

多种区段供选铕（Eu3+）螯合物340nm613nm表1几种常见的荧光物质荧光材料优点：普通荧光微球成本较低光源与光电接收器不在同一直线上，激发光不直达检测器，荧光信号可量化范围大，提高分析灵敏度显色多样，可满足多合一检测不足：不同材料需匹配不同光路系统超微量分析中激发光及散射光可干扰结果部分天然样本中存在本底干扰荧光易淬灭，长期保存不稳定图6荧光光度计光路革新设计（来源：ESEQuant）普通荧光材料优点：荧光寿命长（Eu3+730μs，普通荧光基团1-100μs，样本中蛋白质荧光1-10μs）Stokes位移大，显著降低杂色光影响（Eu3+约290nm，传统荧光素30-60nm）发射光谱带窄，荧光特异性强（Eu3+615±5nm）不足：镧系离子螯合物荧光亮度较低，需结合纳米微球或解离-增强技术放大信号图7消除样品荧光干扰原理及镧系元素的Stokes位移示意图（来源：PerkinElmer）时间分辨荧光材料上转换磷光材料上转换磷光材料(Up-convertingPhosphor,UCP)：又称稀土元素晶体合成材料，是由两种不同镧系元素离子（分别作为光吸收子和发射子）掺杂入亚微米尺寸的陶瓷颗粒中，构成的一类能在红外光（波长>780nm）的激发下，发射可见光（波长475nm-670nm）的材料。UCP作为标记物应用于生物领域，与普通荧光颗粒相比具有无淬灭、无背景、高敏感性、高稳定性等特点。图8普通荧光与上转换发光原理对比动画（来源：网络）量子点量子点(QuantumDots,QDs)：粒径1-10nm的半导体纳米晶，由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激发后可发射荧光。常见的有单核量子点(CdSe,CdTe,CdS)和核-壳型量子点

(CdSe/ZnS,CdSe/ZnS)。优点：发射光颜色与粒径大小相关联，可多色标记；荧光单色性好、亮度高，适用于高灵敏度检测；吸收光谱宽且连续，单一光源可同时激发不同波长的量子点；荧光稳定性好，试剂无需避光即可长期室温保存，适用于测定结果的追溯；比表面积大，节约原料成本不足：不同批次产品粒径需严格控制。图9核-壳型量子点结构示意及不同发射光的量子点（来源：网络）时间分辨荧光分析法技术简介时间分辨荧光免疫检测技术(TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，采用镧系元素及其荧光配合物作为标记物，与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三大超灵敏检测技术，在医学临床检测、生物学科研检测方面有较广泛的应用。技术特点荧光分析的光电接收器与激发光不在同一直线上，激发光不能直达光电接收器，从而大幅提高了光学分析的灵敏度。镧系元素荧光发射波长与激发波长差异巨大，发射波峰窄，可较大避免普通紫外-可见光分析法中杂色光的影响。镧系元素特有的超长时间荧光寿命，使检测在关闭激发光源的情况下进行，可很好地解决激发光及散射光干扰。综上，采用时间分辨技术收集荧光信号，结合荧光强度和相对荧光强度比值判断反应体系中分析物的浓度，可获得较高的灵敏度和较宽的线性范围，为定量分析提供巨大支持。时间分辨荧光分析法技术背景1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini

和Hemmila首次提出了建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论；1983年，Soini

和Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术，Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素(hCG)进行了时间分辨荧光免疫分析；1984年，Hemmila确定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成为Wallac的专利技术；1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen；2003年，我国多位专家联合攻关的课题“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究”（由第二军医大学海医系防原医学教研室韩玲、陈杞教授领衔的课题组，联合上海新波生物技术有限公司、解放军总医院和中国医学科学院放射医学研究所共同完成）

，荣获2003年度国家科技进步二等奖。材料特性三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐(Sm)，铽(Tb)，镝(Dy)等，区别于普通高分子荧光物质，它们的荧光光谱具有以下特性：荧光寿命长镧系元素螯合物：60~900us普通荧光基团：1~100us样本中蛋白质荧光：1~10us（易猝灭）Stokes位移大铕：激发340nm、发射613nm（约290nm）传统荧光素：Stokes位移较小（30~60nm）荧光特异性强发射光谱带很窄：615±5nm时间分辨荧光分析法图10

普通荧光物质与稀土离子荧光光谱对比时间分辨荧光分析法图2Eu离子荧光光谱Stocks位移图3四种稀土元素荧光寿命对比图图11Eu离子荧光光谱Stocks位移图12四种稀土元素荧光寿命对比图目前，根据信号增强技术的不同，TRFIA可分为三种类型：解离再增强技术(DELFIA)、CyberFluor系统(FIAgen)，以及基于纳米微球的TRFIA(Nano-TRFIA)。解离再增强技术：DELFIA技术采用了异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2连接。在中性或接近中性pH条件下，DTTA与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu

又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大。CyberFluor系统：FIAgen技术以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量分析。由于BCPDA的可检测性不够理想，FIAgen

需要利用生物素-亲合素信号放大来弥补BCPDA检测灵敏度的不足。基于纳米微球的时间分辨荧光技术：Nano-TRFIA是一种全新的时间分辨荧光检测手段，它结合了镧族元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，将镧族元素Eu3+及其配合物共同掺杂在纳米及微球上，经过表面活化后，将抗体标记于标记物表面，形成复合物，将该复合物用于免疫检测，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围，其实际性能不低于DELIFA技术。时间分辨荧光分析法产品列表上海新波生物科技–Anytest系列、EasyCuta1260（技术专利、医学检验试剂及仪器）上海微测生物科技–Eu/SmTRFNanoParticles（荧光微球及技术配套）上海西宝生物科技–EasyCompFluorescentParticles（荧光微球）广州丰华生物工程–泰莱-I、泰莱-II（医学检验试剂及仪器）广州达瑞抗体工程（医学检验试剂）上海甄准生物科技（荧光微球）上海优你生物科技（技术专利、食安检测试剂及仪器）美国-芬兰PerkinElmer-Wallac–Victor2（仪器）法国-英国HORIBAJobin

Yvon-IBH–FluoroMax

（仪器）TRFIA应用TRFIA应用食品行业对毒素、药残、非法添加剂的检测要求操作简便、速度快、成本低定性、半定量、定量分析判定准确、灵敏度高抗干扰力强，对复杂样本变异小试剂稳定，便于运输及保存环境友好（部分条目：对比相应技术已成熟的医学检验试剂及配套设备更具挑战性的技术难点）TRFIA应用荧光读数仪属于发射光谱类产品，检测的是荧光物质吸收光能量后处于激发态的分子发出的辐射，由于对激发光源有特殊要求，检测时仅针对某些特殊物质，精度较分子吸收光谱类产品（如紫外分光光度计）较高。荧光物质特性（材料量子效率、吸收光谱、最大激发光波长、荧光谱带、最大发射光波长、荧光寿命）与荧光仪特定参数（激发光波长、激发光单色性、发射光波长）的匹配程度会直接影响荧光信号的响应强度，因此应在进行试剂仪器匹配之前确认两者光学参数，以达到高效使用原材料的目的。荧光物质在发射光谱某一位置的荧光强度，通常用发射峰面积表示，其取值大小受仪器设置参数影响，为相对值。在订制化需求中，因无确定的标准物质做荧光强度的实际值参照，此类直读型仪器没有示值误差的检定规范；而应客户要求，仪器的批次间差异应控制在较小范围，以保证试剂研发用机-量产检测用机的测定结果相符。除误差检验外，同时需主要考察的指标为重复性、稳定性及检出限等。受激发光源、滤光片等光学部件差异及仪器内部零件杂散光的影响，不同荧光仪对同一物质进行测量会得到不同的响应强度，可通过仪器厂家调节光电转换函数来降低差异。在实际测定中，荧光物质的光漂白特性、样品浓度及厚度的均一度、样品表面与发射光检测器间距等因素可引起对同一样品多次重复测量的结果变化。宜选用抗逆性优良（耐强光漂白）的荧光物质，在低荧光背景的平滑材质上定量、均匀涂布以制备样品，并设计充分覆盖实际应用范围的参考系列，作为仪器间校准的计量标准。供应厂商