第十章基因工程的应用

专一改变基因中某一个或某些特定氨基酸的技术。二、定点突变（site-specificmutagenesis）加拿大科学家MichaelSmith1985年建立，并与1993年获Nobel化学奖。本文档共110页；当前第1页；编辑于星期三\14点40分1.M13DNA进行的寡核苷酸介导诱变（1）条件①所要改变的基因编码区的精确的核苷酸序列。②所要引入的氨基酸变化。（2）方法①取得目的基因。GGCTTACCGAAT5’5’3’3’本文档共110页；当前第2页；编辑于星期三\14点40分②插入到双链形式的M13噬菌体载体中③分离出M13正链重组载体GGCTTACCGAATGGCTTA本文档共110页；当前第3页；编辑于星期三\14点40分④合成带有突变核苷酸的目的基因寡核苷酸片段CCGAAG5’3’⑤带有突变核苷酸的寡核苷酸片段与M13（+）链复性。错配的核苷酸位于片段的中部，以利于复性杂交。GGCTTACCGAA5’3’G本文档共110页；当前第4页；编辑于星期三\14点40分⑥以寡核苷酸链作引物，以M13（+）作模板,用Klenow片段合成M13（-）链。GGCTTAGCCGAA5’3’⑦用T4DNA连接酶连接结成完整的双链GGCTTACCGAAG本文档共110页；当前第5页；编辑于星期三\14点40分⑧转化大肠杆菌，噬菌体DNA在大肠杆菌中扩增，形成一半野生型M13双链DNA，一半突变型M13双链DNA噬菌体。野生型CCGAAG诱变型GGCTTCGGCTTACCGAAT（M13的复制型是双链环状DNA）。母链本文档共110页；当前第6页；编辑于星期三\14点40分（3）缺点：⑨分离提取M13双链DNA，再转化大肠杆菌，用寡聚核苷酸探针挑选突变型载体克隆。⑩切下突变基因，接到表达载体中表达诱变的蛋白质。通常只有1%-5%的噬菌斑含有突变的基因。（4）改进：目的基因插入双链形式的M13噬菌体后，转入特殊的受体菌株中。本文档共110页；当前第7页；编辑于星期三\14点40分2.寡核苷酸介导的PCR诱变（1）方法①将目的基因克隆到质粒上。②在欲突变的位置上设计两对引物，分别带有两条链的突变核苷酸。本文档共110页；当前第8页；编辑于星期三\14点40分ATGCATGCATGCATGCTACGTACGTACGTACGATGAATGCATGCTACGATGCATGCATGCATGCTACGTACGTACGTACGCATGCTACGTACTTACP1P2P3P4本文档共110页；当前第9页；编辑于星期三\14点40分③分别进行PCR，扩增出线性的全长质粒。但两组PCR产物的末端位置不同。TACTTACGTACGATGCATGAATGCATGCTACGGTACGATGCATGAATGTACGTACTTACCATGC④PCR产物变性成单链，混合后复性，形成具有粘性末端的杂交双链（1-4；2-3）。1234本文档共110页；当前第10页；编辑于星期三\14点40分TACTTACGTACGTACGGTACGTACGTACTTACATGCATGAATGCATGCATGCATGAATGCATGC⑤环化成有两个切口的开环质粒。用连接酶连接或直接转入细菌（细菌会修复切口）。1423粘性末端粘性末端本文档共110页；当前第11页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第12页；编辑于星期三\14点40分3.改进型双引物诱变方法（是目前较常用的方法之一）：①目的基因克隆到M13噬菌体载体中。②分离提取M13单链DNA作模板。③设计两个不同区段的PCR引物，延伸方向一致，其中一个引物的5’端磷酸化。引物1上引入突变核苷酸。引物2对应于载体上的一个单一酶切位点，并将这个位点突变一个核苷酸，使内切酶无法识别。（一般设计在抗菌素抗性基因内）。本文档共110页；当前第13页；编辑于星期三\14点40分ATGCATGCATGCATGCTACTTACGTACG欲突变的位点引物1CTGGAATTCATGCGACGACCTTAAATACG引物2单一酶切位点P磷酸化④用DNA聚合酶延伸后用T4DNA连接酶连接成杂交双链。本文档共110页；当前第14页；编辑于星期三\14点40分ATGCATGCATGCATGCTACTTACGTACGCTGGAATTCATGCGAC⑤用引物2对应的单一限制性内切酶切杂交双链，会得到模板链被切开一个口但新生的链完整的杂交双链环。EcoRI酶切口⑥转化修复缺陷型大肠杆菌。GACCTTAAATACG本文档共110页；当前第15页；编辑于星期三\14点40分4.重叠延伸诱变⑦模板链由于已经成为线性分子，且又不能被修复，所以不能在菌体内稳定存在，只剩下新生的突变链在菌体内复制。①目的基因克隆到载体上（不一定是M13）。②设计两对引物：引物1和引物2是目的基因两端的载体上的通用引物；引物3和引物4是与突变位点对应的反向互补序列。本文档共110页；当前第16页；编辑于星期三\14点40分12CTGCTACGGGACGATGCCCTGCTGCGGGACGACGCC引物3引物4⑤分别以引物1、4和引物2、3为组合进行PCR。结果形成带有突变的基因的左右两个部分。GACGACGCCCTGCTGCGG14CTGCTGCGG3GACGACGCC2本文档共110页；当前第17页；编辑于星期三\14点40分⑥两组PCR产物混合后变性、复性，可能形成下列两种杂交链，其中一种复性方式能够进一步在3’端继续延伸，补足全长基因序列。1G4C2C3G不能延伸能延伸1G2C带突变的全长基因本文档共110页；当前第18页；编辑于星期三\14点40分⑦除去多余的引物，用通用引物1、2依次为模板进行PCR扩增。得到含有预期突变位点的基因。1G2C12⑧插入载体进行表达突变的产物。本文档共110页；当前第19页；编辑于星期三\14点40分第二节基因工程生产抗体每一种生物的生命都始终经受着其他物种的威胁。——自然法则之一本文档共110页；当前第20页；编辑于星期三\14点40分一、抗体（antibody）1.脊椎动物的免疫系统有三种基本的工作形式：（1）细胞免疫（cellularimmunity）T细胞中的一类（KillerTcell）杀死被病原感染的细胞。T细胞中的另一类（HelperTcell）对病原做出反应，分泌蛋白质（淋巴因子）刺激机体作出整体反应（如产生巨噬细胞等）。（2）淋巴免疫（3）体液免疫B细胞分泌抗体与病原结合。本文档共110页；当前第21页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第22页；编辑于星期三\14点40分二、抗体的结构和功能（1）抗体的结构有两条相同的重链（H）和两条相同的轻链（L）组成的Y字形四聚体。本文档共110页；当前第23页；编辑于星期三\14点40分（2）抗体各部位的功能①抗体的抗原识别位点位于H链和L链的N端（Y字形的支角上）。②恒定区（C区）有三个互补决定区（CDR）组成，这三个CDR都位于H链和L链的N端的可变区内（VH、VL）重链上有3个（CH1、CH2、CH3），轻链上有1个（CL）。不同的抗体分子的恒定区的差异只有一个或两个氨基酸。本文档共110页；当前第24页；编辑于星期三\14点40分抗体分子的空间结构本文档共110页；当前第25页；编辑于星期三\14点40分（3）木瓜蛋白酶处理后的抗体的结构木瓜蛋白酶可将抗体分解成3各部分：①两个Fab片段：属于Y字形的两个角。包含完整的L链和H链的VH和CH1②一个Fc片段是Y字形的柄部。包括两条重链的CH2和CH3本文档共110页；当前第26页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第27页；编辑于星期三\14点40分（4）Fab和Fc片段的功能①Fab具有抗原结合活性和特异性。其实只要Fab上的VH和VL（合称Fv片断）即可。②Fc片段没有抗原结合活性，但它是抗原结合到抗体上后激发机体免疫反应的主要部位。本文档共110页；当前第28页；编辑于星期三\14点40分三、抗体的表达系统1.在重组噬菌体中筛选生产抗体（1）原理：抗体分子的Fab（Fv片段）是抗原的结合区。Fv片段编码重链和轻链的基因形成任意组合，然后检测他们与所需抗原的结合能力。（2）克隆载体分别克隆H链和L链的Fv片段，形成两种链的cDNA文库。载体或M13载体。本文档共110页；当前第29页；编辑于星期三\14点40分丝状噬菌体（单链环状DNA）。如M13、fd、f1等。（3）表达载体本文档共110页；当前第30页；编辑于星期三\14点40分Filamentousphagefd本文档共110页；当前第31页；编辑于星期三\14点40分g3p：外壳蛋白3；其余类似。本文档共110页；当前第32页；编辑于星期三\14点40分（3）方法噬菌体展示（Phagedisplay）：将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。细菌表面展示（Bacteriasurfacedisplay）本文档共110页；当前第33页；编辑于星期三\14点40分①从经过免疫的小鼠或人的B细胞中分离mRNA（既有重链也有轻链的mRNA）。②反转录制备cDNA。③设计一对重链的引物和一对轻链的引物，通过PCR将重链和轻链的cDNA扩增。④用特定的限制性内切酶切PCR产物。本文档共110页；当前第34页；编辑于星期三\14点40分⑦辅助M13噬菌体：噬菌体外壳蛋白基因完整。⑧从H链文库和L链文库中随机切出H链和L链片段，把酶切后的H链和L链片断连接，随机克隆到M13载体的外壳蛋白3（或8）下游，形成融合蛋白文库。（抗体组合文库）⑤把重链和轻链的cDNAPCR片段分别克隆到克隆载体中，制成cDNA文库。⑥构建M13载体：只包含外壳蛋白3（或8基因）、细菌和病毒复制起点。本文档共110页；当前第35页；编辑于星期三\14点40分⑩提取各噬菌斑的重组噬菌体颗粒，与抗原进行亲和分析，寻找结合力最强的噬菌体。⑾分析亲和力强的载体上的抗体基因组合序列，转到其他的表达载体上表达。⑨重组载体与辅助载体共同感染细菌，形成有重组的M13外壳（3蛋白或8蛋白上连着抗体片段）的M13（内部所包装的DNA绝大多数是载体，辅助载体DNA复制效率差）。本文档共110页；当前第36页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第37页；编辑于星期三\14点40分第三节基因工程生产疫苗一、传统疫苗1.民间：利用天花的干痂来预防天花。1796年乡村医生EdwardJenner用一种温和的奶牛的疾病牛痘感染人类，发现牛痘感染过的人不会再被天花感染。2.第一次获得了真正意义上的疫苗Jenner把从牛逗脓疮中得到的渗出液注射到8岁的小男孩JamesPhipps的体内，经过3次注射后，Phipps对天花有了完全的抗性。本文档共110页；当前第38页；编辑于星期三\14点40分19世纪末，LouisPasteur制成狂犬病疫苗。VonBehring制成白喉病疫苗。KitasatoShibasaburo制成破伤风病疫苗现在人类已经获得了麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎等病的疫苗。3.疫苗的发展但对艾滋病、疟疾、肺结核等依然束手无策。可能是需要细胞免疫（只有减毒活疫苗才能有效地诱发细胞免疫）。本文档共110页；当前第39页；编辑于星期三\14点40分典型的疫苗主要是灭活的和减毒的致病物质。病源物在培养、纯化后，或者被灭活，或者被降低毒性，但前提是不能丧失其引起免疫反应的能力。4.疫苗的成分5.传统疫苗的局限性（1）有些致病物无法在培养基上生长，所以很多病没办法获得疫苗。（2）动物和人的病毒需要在动物细胞中培养，成本极高。本文档共110页；当前第40页；编辑于星期三\14点40分（3）培养的动物或人类病毒的生长速度和产量一般较低。（4）需要对实验室和实验人员采取保护措施。（5）疫苗中的致病物质在生产中有可能没有被完全杀死或充分减毒。（6）减毒的菌株有可能发生突变。（7）有些疾病（如AIDS）用传统的疫苗防治效果甚微。（8）绝大多数现行的疫苗的有效期都很短，并需要冷冻保存，不利于在落后地区推广。本文档共110页；当前第41页；编辑于星期三\14点40分二、基因工程疫苗用基因工程的方法表达出病源物的一段基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无感染能力、但有较强的免疫原性）用作疫苗。目前使用的多数乙肝疫苗就属于基因工程疫苗。1.亚基疫苗（subunitevaccine）利用病源物的某一部分制得的疫苗称为亚基疫苗。本文档共110页；当前第42页；编辑于星期三\14点40分①亚基疫苗非常适合于用基因工程技术生产。②避免了直接使用病源物带来的危险。③利用纯化的蛋白质作免疫源，避免了由于外源蛋白和核酸的混杂造成的副作用。缺点①纯化蛋白十分昂贵。②纯化后的蛋白的构象可能与在体内时不同，导致抗原性发生变化。③亚基疫苗不具备感染性，所以一般不能激活MHCI分子，也就很难激活杀伤性T细胞。（1）亚基疫苗的优缺点：优点本文档共110页；当前第43页；编辑于星期三\14点40分（2）亚基疫苗举例①单纯疱疹病毒（HSV）疫苗衣壳呈20面体，周围有一层无定形的物质（壳皮）覆盖。壳皮外是类脂双层膜。基因组是线性双链DNA，长152.5kb，含有末端重复序列和内部重复序列。TRL长独特区ULIRL

IRS短独特区USTRS长基因组区短基因组区HSV的核心是缠有DNA的纤丝卷轴，纤维的末端在衣壳下侧固定。本文档共110页；当前第44页；编辑于星期三\14点40分HSV颗粒中至少有33种蛋白，其中一半是糖蛋白。制备亚基疫苗的基本前提是鉴定出哪些成分能激发机体产生抗体。HSV-1型的衣壳蛋白D（gpD）就是能引起老鼠产生完整的HSV抗体的成分。gpD是个膜蛋白，把其跨膜区删除，成为分泌蛋白，成为疫苗。膜N端（膜外）C端（膜内）跨膜区膜CN改造过的gpD本文档共110页；当前第45页；编辑于星期三\14点40分②口蹄疫病毒（FMDV）疫苗传统的口蹄疫疫苗是用甲醛灭活的口蹄疫病毒。FMDV中得到抗体产生的主要成分是病毒衣壳蛋白1（VP1）。（foot-and-mouthdiseasevirus）FMDV是单链RNA病毒。对牛和猪有极强的毒性。将VP1的cDNA克隆表达、纯化。本文档共110页；当前第46页；编辑于星期三\14点40分2.肽疫苗衣壳蛋白组成的外壳病毒衣壳病毒核酸动物病毒结构根据动物病毒的结构，可以推测：只有位于衣壳外表的蛋白结构域才能引起免疫反应。因此只需要合成衣壳蛋白的抗原决定簇（小肽）就可以当作疫苗。本文档共110页；当前第47页；编辑于星期三\14点40分VP1C端的3个肽段（141-160aa、151-160aa、200-213aa）和N端的3个肽段（9-24aa、17-32aa、25-41aa）分别接到载体蛋白上（提高小肽的稳定性）。结果：141-160aa的肽段能诱导豚鼠产生足够的FMDV抗体。如果把141-158aa与200-213aa两个肽段连起来，不用载体蛋白稳定就能激发豚鼠产生高水平的抗体。比任何一个肽段单独使用更有效。本文档共110页；当前第48页；编辑于星期三\14点40分把VP1的142-160aa序列于具有强免疫源性的载体蛋白——乙肝抗原蛋白（HBcAg）连接，会自动组装成“27nm”颗粒，VP1的小肽恰好位于颗粒外表面。这可能成为未来投送肽疫苗的常规方法。肽疫苗的局限性：肽段不能太长、肽段的构象与抗原决定簇的构象要一致、必须有足够强的免疫源性。本文档共110页；当前第49页；编辑于星期三\14点40分3.活体重组疫苗用基因工程的方法对细菌和病毒进行改造，使之成为活体重组疫苗（liverecombinantvaccine）组成：可以是非致病的微生物，用基因工程方法使之带上并表达某种特定病源物的抗原决定簇基因，产生免疫原性。也可以是本来的致病微生物，通过基因改造去掉毒性基因后仍保持免疫原性。本文档共110页；当前第50页；编辑于星期三\14点40分霍乱活体重组疫苗的制作病原菌：霍乱弧菌（Vibrocholerae）致病物：肠毒素。肠毒素的结构：1个A亚基和5个相同的B亚基。A亚基有ADP糖基化活性，有两个功能域：A1肽（毒性区，194aa）、A2肽（连接A1和B亚基）。亚基疫苗对霍乱菌的感染没有免疫作用。利用重组DNA技术破坏A1肽的基因序列，使突变的菌株不能产生肠毒素，成为非致病菌，做疫苗。本文档共110页；当前第51页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第52页；编辑于星期三\14点40分4.细菌疫苗在非致病菌的细胞表面插入致病菌的表面抗原。在细菌的鞭毛蛋白的高变区基因中插入霍乱菌素B亚基的50个氨基酸的DNA片断。然后把重组DNA导入无鞭毛的沙门氏菌株。实验证明转入后的表达产物既有正常的鞭毛功能，又能激发小鼠产生高水平的针对霍乱菌素的抗体。本文档共110页；当前第53页；编辑于星期三\14点40分5.肿瘤疫苗肿瘤疫苗的应用基础是存在肿瘤特异性抗原，同时免疫系统对该抗原能够产生有效的应答。(1)肿瘤细胞疫苗用肿瘤细胞作为抗原而制备的疫苗（必须事先灭活）。（2）基因工程肿瘤疫苗将不同的外源基因导入肿瘤细胞后再制成疫苗。机理不十分清楚、效果很差。仍需努力。本文档共110页；当前第54页；编辑于星期三\14点40分6.DNA疫苗1993年Wolff等意外地发现将DNA直接注射到小鼠骨骼肌细胞后可直接引起特异性免疫反应，而且可以持续2个月以上。1994年和1995年WHO和美国科学院分别召开专题会议讨论DNA免疫的应用前景。流感病毒的核心蛋白抗原（NP）表达载体小鼠骨骼细胞流感病毒小鼠存活率提高50%！本文档共110页；当前第55页；编辑于星期三\14点40分（1）DNA疫苗的构成DNA疫苗是指含有一种病原体抗原编码基因的重组质粒DNA。①抗原编码基因对于不易变异的病原：选用病原体表面糖蛋白编码基因。对于容易变异的病毒：选择各型共有的核心蛋白基因中的保守DNA序列。i）选用本文档共110页；当前第56页；编辑于星期三\14点40分ii）抗原编码基因的分离和筛选表达文库免疫技术（ELI）Expression-libraryimmunization)基本原理：病原体的DNA片段特定的质粒病原基因文库分别进行DNA免疫测试筛选病原基因组中最具有免疫激活反应的DNA片段本文档共110页；当前第57页；编辑于星期三\14点40分②质粒表达载体大多数采用pUC系列的质粒基本骨架。基本组成元件：细菌复制起点（ColEIori）。细菌抗性基因（Ampr、Kanr）。PolyA加尾信号。CpG序列（增强DNA免疫活性）。哺乳动物强启动子（CMV、SV40）。CMV：cytomegalovirus（巨细胞病毒）。本文档共110页；当前第58页；编辑于星期三\14点40分（2）DNA疫苗的作用机理与重组亚基疫苗类似，都是利用单一的蛋白质抗原分子来诱导免疫反应。（3）DNA疫苗的优点①既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫。②同一个质粒上可以容纳多个抗原基因，有可能获得对多种疾病的免疫能力。③DNA比蛋白质容易制备和保存。（4）DNA疫苗的缺点①普遍存在免疫效力低的问题。②安全性问题（整合位点、后果）本文档共110页；当前第59页；编辑于星期三\14点40分（5）DNA疫苗的改进①载体的优化增强载体的表达能力：如采用增强子—启动子复合物。提高载体的复制能力：（DNA疫苗不能自我复制）甲病毒（alphavirus）是个负链RNA病毒，编码复制酶（具有自我水解功能）。可以在寄主细胞内独立复制。有可能利用该病毒作载体（用外源基因替换其结构基因）。本文档共110页；当前第60页；编辑于星期三\14点40分用CpG序列优化载体：试验表明适当长度的非甲基化的CpG序列对提高DNA疫苗的免疫原性具有重要的作用。本文档共110页；当前第61页；编辑于星期三\14点40分第四节人类疾病的基因治疗迄今为止，还没有遗传病患者经传统的治疗方法治疗后能过上正常人的生活，他们的后代也同样难逃厄运。临床统计：25%的生理缺陷、30%的儿童死亡、60%的成年人疾病都是由遗传疾病引起的。本文档共110页；当前第62页；编辑于星期三\14点40分一、基因治疗的回顾和现状（1）基因治疗的概念向靶组织或细胞中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。（2）基因治疗的发展1973年一名美国医生在德国给一对姐妹（缺少一种稀有的酶）注入肖普氏乳头瘤病毒，结果无效。本文档共110页；当前第63页；编辑于星期三\14点40分第二例是在1980年，美国一名医生对两名地中海贫血患者进行基因治疗。由于未得到NIH的批准，受到广泛的抨击。后来开始在动物身上进行试验。NIH及其下属的重组DNA顾问委员会经过长期的审查，终于批准了美国第一例临床治疗申请。1990年9月14日正式开始，由Genetictherapy公司和NIH。患者：两位患严重综合性免疫缺损症（SCID）（缺少腺苷酸脱氨酶（ADA））的姑娘。本文档共110页；当前第64页；编辑于星期三\14点40分第一位接受基因治疗的人AshantiDiSilva本文档共110页；当前第65页；编辑于星期三\14点40分方案：把克隆的腺苷酸脱氨酶基因转入患者的T淋巴细胞，培养后再转入患者体内。疗效：AshantiDiSilva的症状有所改善，25-30%的T细胞能维持正常的ADA水平，至今生活正常。但与她同时接受治疗的另一位女孩失败了。本文档共110页；当前第66页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第67页；编辑于星期三\14点40分1991年Rosenberg等对50名黑色素瘤晚期患者进行基因治疗，取得一定的效果。迄今为止，所有的基因治疗方法都是针对体细胞的，处于伦理、安全、技术上的考虑，性细胞基因治疗方案尚未被列入研究日程。方案：把外源的肿瘤坏死因子基因转入肿瘤侵润淋巴细胞（TIL），结果这种TIL能集中在肿瘤所在的部位杀死肿瘤细胞。本文档共110页；当前第68页；编辑于星期三\14点40分二、体细胞治疗的生物学问题（1）如何选定并获得用来进行基因治疗的细胞。（2）如何将修正的目的细胞重新引入患者体内。（3）如何控制转入的正常基因的表达。（4）转基因细胞能否在体内增值。本文档共110页；当前第69页；编辑于星期三\14点40分三、基因治疗的方案1.体外—原位（exvivo)基因治疗把病人的体细胞取出，在体外加入正常基因校正，再把校正的细胞放回病人体内。已批准了100多个临床方案。2.体内（invivo）基因治疗原位：将新基因直接引入病人的疾病部位（病毒载体或DNA)。通过血液把治疗性基因带到病组织。本文档共110页；当前第70页；编辑于星期三\14点40分引入目的基因的mRNA的反义序列，与目的基因的mRNA相配对，造成供翻译的mRNA大量减少，制止病基因的表达。也可以引入目的基因的反义DNA。3.反义（antisense）基因治疗。本文档共110页；当前第71页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第72页；编辑于星期三\14点40分反义RNA的作用反义寡聚RNA与mRNA形成双链后，诱使RNaseH把mRNA切断本文档共110页；当前第73页；编辑于星期三\14点40分核酶是一类具有催化活性的RNA分子。参与细胞内多种RNA及其前体的加工和成熟过程。4.核酶（ribozyme）基因治疗。发现者Altman和Cech获1989年诺贝尔化学奖。本文档共110页；当前第74页；编辑于星期三\14点40分1988年，Haseloff和Cerlsch根据核酶RNA的锤头结构设计出第一个具有特异切割活性的人造核酶，并在体证实它确实具有特异性的切割活性。其中利用核酶抗HIV感染的工作尤其受到重视。细胞实验表明，核酶确实具有切割HIV基因组并阻断其复制的效果。本文档共110页；当前第75页；编辑于星期三\14点40分四、基因治疗用的载体1.反转录病毒载体主要是病毒。反转录病毒（ritrovirus）属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。两个相同的RNA分子在5’端附近经氢键连接形成70SRNA，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。基因组结构：类似于真核细胞mRNA反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。本文档共110页；当前第76页；编辑于星期三\14点40分反转录病毒结构本文档共110页；当前第77页；编辑于星期三\14点40分流感病毒本文档共110页；当前第78页；编辑于星期三\14点40分HIV本文档共110页；当前第79页；编辑于星期三\14点40分如Moloneymurineleukemiavirus(MoloneyMLV)envpolgagU3U3U5U5cappolyA3’5’LTRLTRU5、U3：5’段或3’端独特序列。LTR：长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里。LTR本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。RR+本文档共110页；当前第80页；编辑于星期三\14点40分+：组装时必需的非编码序列。env：外壳蛋白。pol：反转录酶和整合酶。gag：核心蛋白。本文档共110页；当前第81页；编辑于星期三\14点40分（1）反转录病毒载体的优点①能稳定地将DNA插入宿主基因组的随机位点上。②侵染范围广、感染率高。③整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低。④包装的外源DNA可达10kb。⑤反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。本文档共110页；当前第82页；编辑于星期三\14点40分（2）用于基因治疗的反转录病毒载体构建①把反转录病毒基因组中的整个pol、env和gag基因的3’端删除。②插入标记基因（如neor）。③外源基因和启动子插入到+下游。5’LTR+外源基因neor3’LTR本文档共110页；当前第83页；编辑于星期三\14点40分反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞。用两个缺失了+的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。（3）包装细胞系的构建本文档共110页；当前第84页；编辑于星期三\14点40分5’LTRgag3’LTRpolenv3’LTR5’LTR病毒外壳蛋白包装细胞本文档共110页；当前第85页；编辑于星期三\14点40分（4）载体RNA的包装①用载体DNA转化包装细胞系转入的载体上带有+，转录成的载体RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。5’LTR+外源基因neor3’LTR（5）利用这种重组病毒颗粒，高效转染靶细胞进行基因治疗。本文档共110页；当前第86页；编辑于星期三\14点40分2.腺病毒（adenovirus）载体（1）腺病毒的基因组：（2）腺病毒的优点：①比较安全，无致病、致癌、致畸作用。②宿主范围广，不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。线状双链DNA病毒，基因组中有14个基因。共同特点是都带有倒置的末端重复（ITR），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。本文档共110页；当前第87页；编辑于星期三\14点40分腺病毒的结构本文档共110页；当前第88页；编辑于星期三\14点40分③可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式进行基因治疗。④载体中的插入片段可达7.5kb（有包装容量限制）。⑤腺病毒容易制备、纯化。⑥基因组结构和功能了解得清楚。是目前最常用的基因治疗载体之一。本文档共110页；当前第89页；编辑于星期三\14点40分①把腺病毒DNA删除一些非必须区（如E1或E3区），增加插入能力。②构建质粒，含有E1或E3区两侧的同源序列。两侧序列之间插入外源基因和选择标记基因。（3）腺病毒载体的构建用同源重组的方法插入外源基因。ITRE1ITRE3本文档共110页；当前第90页；编辑于星期三\14点40分③把质粒切成线性。④质粒与病毒DNA（缺失E1或E3）共同转染细胞，在细胞中发生同源重组，把外源DNA加到病毒基因组中。⑤分离重组腺病毒，成为基因治疗的载体。本文档共110页；当前第91页；编辑于星期三\14点40分（4）重组腺病毒DNA在细胞中的生存①以游离的附加体形式存在于细胞中，不能整合到细胞基因组中。基因表达时间短。②E1是腺病毒繁殖的必须区。缺失E1的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖。③E3区在腺病毒的繁殖过程中不是必需的。缺失E3的重组腺病毒不需要辅助病毒。本文档共110页；当前第92页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第93页；编辑于星期三\14点40分本文档共110页；当前第94页；编辑于星期三\14点40分五、癌症的基因治疗国际上已批准的130多种基因治疗方案中，70%是针对癌症的。（1）癌症的基因治疗中常用的治疗性基因①直接杀伤或抑制癌细胞生长的基因：抑癌基因、癌基因的反义序列、编码细胞程序性死亡的基因等。②可提高免疫系统能力的基因：细胞因子基因等。本文档共110页；当前第95页；编辑于星期三\14点40分（2）导入抑癌基因的基因治疗③多种药物的耐药性基因：主要目的是提高造血细胞及其他细胞对放疗、化疗及其他抗癌药物的耐受性。癌症一般是