细菌内毒素检测技术与应用详解演示文稿

细菌内毒素检测技术与应用详解演示文稿本文档共67页；当前第1页；编辑于星期一\18点49分优选细菌内毒素检测技术与应用本文档共67页；当前第2页；编辑于星期一\18点49分1、热原

--热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质。--Webster将热原定义为“致热剂”。

本文档共67页；当前第3页；编辑于星期一\18点49分1)早期的热原研究

–静脉疗法的研究与热原的研究密切相关–在18,19世纪有很多关于静脉疗法的报道,所有病人在注射后都伴随有发热反应,当时的医生都深信发热对人体有益–1912年,Hort和Penfold阐明注射发热的真正本质,将细菌分为热原和非热原两种:

A、革兰氏阴性细菌为热原细菌B、革兰氏阳性细菌为非热原细菌

–他们推断出所有的注射发热都是由革兰氏阴性细菌产生的可滤过的,热稳定的物质导致的

本文档共67页；当前第4页；编辑于星期一\18点49分2)热原的检测–1941年,美国USP,FDA和NIH(美国国家卫生研究所)邀请了14个制药厂商参与第一次热原的协作研究。–1942年,美国药典第一次收载热原检查法

该方法是将一定量的供试品通过静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况来判定供试品中所含热原量是否符合规定。3)细菌内毒素检查(BET)

–利用鲎试剂来检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素,用以判断供试品中细菌内毒素含量是否符合规定

本文档共67页；当前第5页；编辑于星期一\18点49分2、历史回顾——鲎试剂与细菌内毒素检查1)国际

–1956年,美国科学家FredericBang发表论文《鲎的一种细菌性疾病》,阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象.随后,Bang和Levin发明了鲎试剂。

–1980年,FDA发表使用鲎试剂检查人用和兽用注射药终成品内毒素的准则;美国药典20版(USPXX)收载BET法。–1989年英国药典收载BET法–1991年日本药局方收载BET法。

本文档共67页；当前第6页；编辑于星期一\18点49分

–1999年,USPXXIV版规定670种药品用BET法检查,保留热原检查的药品约20种。–2000年,国际调和委员会使USP,EP和JP达成《BET的国际调和案》,统一的BET法收载于USPXXIV版NF19的第二增补本中,并于2001年1月1日生效

本文档共67页；当前第7页；编辑于星期一\18点49分2)国内

–1983年,由11个单位参加的卫生部鲎试剂研究协作组的成立。–1988年,卫生部颁布《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标准–1991年,卫生部部颁标准规定4种药品可使用细菌内毒素检查法。–1993年,中国药典(CP)九零版第二增补本收载BET法。–1995年版CP规定13个品种使用BET法。

本文档共67页；当前第8页；编辑于星期一\18点49分

–2000年,CP2000版细菌内毒素检查品种增至69种;附录《细菌内毒素检查法应用指导原则》中收录了BET定量法。–2005年,CP2005版细菌内毒素检查品种增至168种;BET法正式收载光度测定法。

本文档共67页；当前第9页；编辑于星期一\18点49分3、BET发展趋势与特1)BET技术的发展趋势

(1)细菌内毒素检查取代热原检查

-BET法所具有的优点:快速,灵敏,可标准化等

(2)走向统一的BET法-WHO实现了内毒素的国际标准品(IS)的效价(IU)与各国内毒素标准品的效价(EU)的统一,即1IU=1EU。

本文档共67页；当前第10页；编辑于星期一\18点49分2)BET技术及应用发展的特点

(1)BET方法呈多样化

–凝胶法

–比浊法-动态比浊法-终点比浊法–比色法-动态比色法-终点比色法

(2)BET趋向自动化

–凝胶法恒温设备方面,干式恒温仪器逐步取代水浴恒温箱

–定量BET试管式定量检测仪酶标板式定量检测仪全自动的BET系统专用的数据软件

本文档共67页；当前第11页；编辑于星期一\18点49分3)BET试剂的发展

–鲎试剂的灵敏度越来越高

凝胶法最高达0.0075EU/ml,商品试剂0.015EU/ml定量法高达0.001EU/ml4)BET应用的领域越来越广

–药品检验–药品生产过程质控–临床应用:辅助诊断–其它领域:食品卫生,环境保护

本文档共67页；当前第12页；编辑于星期一\18点49分二、细菌内毒素的理论基础1、细菌内毒素2、鲎试剂3、BET检查用水4、BET检查程序5、5,2005年版细菌内毒素检查法6、相关参数的计算7、试验相关知识

本文档共67页；当前第13页；编辑于星期一\18点49分1、细菌内毒素

1)化学成分及特性

–革兰氏阴性细菌细胞壁的产物

–是高分子量脂多糖复合物(LPS)

单体分子量介于10,000至20,000道尔顿典型地以100,000至500,000道尔顿的聚合体形式存在

本文档共67页；当前第14页；编辑于星期一\18点49分

(1)特性

-致热性：内毒素作用于人体细胞,使之释放内原性热原,再刺激下丘脑体温调节中枢,引起发热反应。

-耐热性：需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活。

-分子极性：多糖链有亲水性,脂肪链具有疏水性,在水中呈不均匀分布。

-酸碱性：与强酸强碱水解反应。

-鲎反应性：能与鲎试剂发生多级酶促反应,形成凝胶。除上述性质外,LPS还有许多其它的生物活性

本文档共67页；当前第15页；编辑于星期一\18点49分

(2)化学结构

–含有3个截然不同的区域

O-特异侧链

核心多糖

类脂A

本文档共67页；当前第16页；编辑于星期一\18点49分2)细菌内毒素与热原的关系

–内毒素是热原之一种。

–医药工业接受的观点是,内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原,控制内毒素污染就等于控制热原污染。3)标准内毒素与环境内毒素

–标准内毒素

–环境内毒素(主要检测对象)

本文档共67页；当前第17页；编辑于星期一\18点49分4)标准内毒素溶液的制备

–中国药典2005年版BET法要求,将细菌内毒素国家标准品用BET检查用水溶解后,需在旋涡混合器上混匀15分钟,以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟.其他国家的BET法也有类似的要求.

–具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布

本文档共67页；当前第18页；编辑于星期一\18点49分5)内毒素的清除方法

(1)冲洗(2)蒸馏

(3)反渗透

(4)超滤(5)活性炭吸附6)内毒素的灭活方法

(1)酸/碱水解(2)氧化(H2O2)(3)干热(180℃2h或250℃30min)

本文档共67页；当前第19页；编辑于星期一\18点49分2、鲎试剂

1)鲎试剂的分类

(1)种类：美洲鲎试剂和中国鲎试剂；(2)检测方法：凝胶法和光度法；(3)特异性：普通和特异性鲎试剂。

本文档共67页；当前第20页；编辑于星期一\18点49分2)鲎试剂的规格

(1)单次实验试剂(2)多次试验试剂3)鲎试剂的质量标准

(1)灵敏度

●定义：在细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生阳性的标准内毒素的最低浓度，单位为EU/ml。常用的鲎试剂的灵敏度有：0.25、0.125、0.03。

(2)自身凝集：阴性对照在37度4h不产生阳性反应。

本文档共67页；当前第21页；编辑于星期一\18点49分4)鲎试剂的使用

(1)使用前，应将鲎试剂置于室温环境下使其达到室温后再复溶使用；(2)复溶鲎试剂后，应避免强烈振动产生泡沫；

(3)由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阴性；(4)对鲎试剂有过敏症者应小心使用，小心鲎试剂粉末逸出。

本文档共67页；当前第22页；编辑于星期一\18点49分5)鲎试剂与内毒素的反应机理

本文档共67页；当前第23页；编辑于星期一\18点49分3、细菌内毒素检查用水（BET水）

定义

(1)2010年药典，BET水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水；(2)美国药典要求的BET水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其它水。

本文档共67页；当前第24页；编辑于星期一\18点49分4、细菌内毒素检查和程序

1)验证实验

(1)凝胶法；I、灵敏度复核试验；II、干扰实验(2)光度法；I、标准曲线可靠性验证；II、干扰实验

本文档共67页；当前第25页；编辑于星期一\18点49分2)检查法

(1)凝胶法；I、凝胶限量试验；II、凝胶半限量试验(2)光度法；I、动态法（比浊法、比色法）；II、终点法（比浊法、比色法）；

本文档共67页；当前第26页；编辑于星期一\18点49分三、相关计算1、内毒素限值2、最大有效稀释倍数3、最低有效浓度4、样品称稀释过程中加液量的计算

本文档共67页；当前第27页；编辑于星期一\18点49分1、内毒素限值

--一般按公式L=K/M来确定。A.L为供试品的细菌内毒素限值；B.K为人每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量，注射剂K=5EU/(kg*h)C.M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量。人均体重按60kg计算。

本文档共67页；当前第28页；编辑于星期一\18点49分例子1：注射用头孢曲松钠舒巴坦钠，成人最大剂量为1500mg/次。例子2：注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为2.0~8.0g，分3~4次给药，一日最高剂量不超过12g.

本文档共67页；当前第29页；编辑于星期一\18点49分2、最大有效稀释倍数（MVD）

--供试品MVD按下式计算：MVD=cL/λA.C为供试品浓度，其中当L以EU/ml表示时，c为1.0ml/ml；B.M为内毒素限值；C.λ为鲎试剂的灵敏度（凝胶法）或标准曲线最低点浓度（光度法）。

本文档共67页；当前第30页；编辑于星期一\18点49分例子：如果使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴坦钠（浓度为10mg/ml，L=0.2EU/mg）的最大有效稀释倍数为：

本文档共67页；当前第31页；编辑于星期一\18点49分3、最低有效浓度（MVC）

MVC=λ/LA.λ为鲎试剂的灵敏度（凝胶法）或标准曲线最低点浓度（光度法）；B.L为内毒素限值；

本文档共67页；当前第32页；编辑于星期一\18点49分例子：如果用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴坦钠的最低有效浓度为：

本文档共67页；当前第33页；编辑于星期一\18点49分4、样品稀释过程中加液量的计算稀释过程中，假设从溶液S1取（X）ml溶液稀释（n）倍至S2，加液量为（y）,则满足

Y=（n-1）*x例子：如从溶液S1取0.5ml稀释3.8倍至S2,则加液量为：Y=（3.8-1）*0.5=1.4（ml）,即0.5ml的S1加1.4ml稀释液即得S1的3.8倍稀释液S2。

本文档共67页；当前第34页；编辑于星期一\18点49分5、计算A、2010版药典：紫杉醇注射液细菌内毒素检查：

取本品，加内毒素检查用水稀释制成每1ml中含紫杉醇0.15mg或更低浓度，依法检查每1mg紫杉醇中含内毒素的量应小于0.40EU，问应该选用灵敏度为多少的鲎试剂来做检测？？

本文档共67页；当前第35页；编辑于星期一\18点49分解答：

λ=MVC*L=MVC*0.4EU/mg

药典要求：MVC≤0.15mg/ml，

则选用鲎试剂灵敏度λ

≤0.15mg/ml*0.4EU/mg=0.06EU/ml

本文档共67页；当前第36页；编辑于星期一\18点49分

B、注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠细菌内毒素：

取本品，用内毒素检查用水制成每1ml中含0.6mg的溶液，依法检查，每1mg本品中含内毒素的量应小于0.050EU，问应该选用灵敏度为多少的鲎试剂来做检测？？

本文档共67页；当前第37页；编辑于星期一\18点49分解答：

λ=MVC*L=MVC*0.050EU/mg

药典要求：MVC=0.6mg/ml，

则选用鲎试剂灵敏度λ

=0.6mg/ml*0.050EU/mg=0.03EU/ml

本文档共67页；当前第38页；编辑于星期一\18点49分五、凝胶法细菌内毒素检查技术1、凝胶法BET试验程序2、试验器具3、鲎试剂灵敏度复核4、干扰初筛试验5、检查法6、实验相关知识及技巧

本文档共67页；当前第39页；编辑于星期一\18点49分1、凝胶法BET试验程序A、试验准备；B、确定供试品的内毒素限值；C、选择鲎试剂D、计算最大有效稀释倍数或最低有效浓度；E、鲎试剂灵敏度复核；F、干扰初筛实验；G、干扰实验；H、日常检测

本文档共67页；当前第40页；编辑于星期一\18点49分2、试验器具

器具分类器具名称稀释容器无热原小试管移液器具移液枪(1000ul、200ul)无热原吸嘴(1000ul、200ul)孵育仪器恒温水浴锅

混合食品涡旋混合仪其它试管架、异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、标记笔、锡箔纸本文档共67页；当前第41页；编辑于星期一\18点49分1）试验器具的要求及处理；A、玻璃器皿需经除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后≥250℃干烤至少30min；B、塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械；2）孵育反应仪器反应温度的要求（37±1℃）

本文档共67页；当前第42页；编辑于星期一\18点49分3、鲎试剂标示灵敏度的复核试验1）实验目的A、验证实验的条件是否满足BET实验的要求；B、验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求；C、验证实验所用试剂是否满足BET实验的要求；D、验证实验所用器具是否满足BET实验的要求；

本文档共67页；当前第43页；编辑于星期一\18点49分2）实验步骤A、开启恒温仪器预热；B、标准内毒素溶液的制备；C、鲎试剂的准备；D、加样及恒温反应；E、结果判断；F、数据处理。

本文档共67页；当前第44页；编辑于星期一\18点49分3）操作步骤示意图

内毒素毒素RSE和CSEBET水复溶混匀稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液旋涡混合器混合15分钟鲎试剂TALBET水复溶混匀单次管：原安瓿多次管：反应试管轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合30秒0.1mlTAL+0.1mlCSE（RSE），平行4管NC：0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行2管本文档共67页；当前第45页；编辑于星期一\18点49分37℃±1℃,60±2min结果判断：反应管缓缓倒转1800阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性（-）：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者实验有效：NC管全部呈阴性（--）

2.0λ管全部呈阳性（++++）

0.25λ管全部呈阴性（----）数据处理：灵敏度测定值λc＝antilg(∑X/4)X：为反应终点浓度的对数值（lg）鲎试剂灵敏度标示值λ有效：2λ≥λc≥0.5λ封口，混匀

反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度本文档共67页；当前第46页；编辑于星期一\18点49分4）灵敏度复核实验举例A、试剂

名称厂家规格标志效价数量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml18支CSE安度斯10EU/支10EU/支1瓶BET水安度斯5ml/瓶<0.003EU/ml10瓶本文档共67页；当前第47页；编辑于星期一\18点49分B、标准内毒素的制备

3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.6ml1.0ml0.4ml3.0mlBET水CSE3.0ml3.0ml3.0ml15min30s30s30s30s10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml2λ1λ0.5λ0.25λ本文档共67页；当前第48页；编辑于星期一\18点49分C、鲎试剂的准备和加样

0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.06EU/ml加样顺序从低浓度到高浓度本文档共67页；当前第49页；编辑于星期一\18点49分D、恒温反应

将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇均（避免产生气泡），放入37±1℃的恒温器中孵育60±2min(孵育过程中避免振动影响凝胶形成)。

若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸汽进入反应管内造成污染。

本文档共67页；当前第50页；编辑于星期一\18点49分E、结果判断

阴性阳性本文档共67页；当前第51页；编辑于星期一\18点49分灵敏度实验符合要求的基本条件①NC（阴性对照）管全部为阴性（----）②2λ全部为阳性（++++）③0.25λ全部为阴性（----）计算：

按λc=antilg(ΣX/4)计算反应终点（最后一个呈阳性结果的浓度）的几何平均值；

其中X为反应终点浓度的对数值；

当λc在[0.5λ~2λ]时，灵敏度验证合格。

本文档共67页；当前第52页；编辑于星期一\18点49分F、数据处理例子：

计算：λc=antilg{[(log0.125)+(log0.25)+(log0.25)+(log0.25)]/4}=10-0.67731749=0.210EU/ml∈[0.125,0.5]

平行管内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC0.50.250.1250.061+++--2++---3++--4++--本文档共67页；当前第53页；编辑于星期一\18点49分4、干扰初筛试验1）目的及原理A、本试验是检测样品与鲎试试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2λ内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度；B、本试验可减少干扰实验的盲目性。

本文档共67页；当前第54页；编辑于星期一\18点49分2）实验步骤A、供试品限值的确定；B、供试品最大有效稀释倍数的确定；C、试剂的选择；D、反应溶液的制备；E、加样与反应；F、结果判断。

本文档共67页；当前第55页；编辑于星期一\18点49分3）干扰初筛实验举例A、供试品限度；

硫酸庆大霉素（S），100ml/瓶，20000U/ml;药典要求其限值L=0.5EU/1000U。B、最大有效稀释倍数的确定（MVD=cL/λ）;

灵敏度λ（EU/ml）0.50.250.1250.060.03对应的MVD（倍）204080160320本文档共67页；当前第56页；编辑于星期一\18点49分C、试剂的选择；

为了方便试验，干扰初筛试验一般选择灵敏度较低的鲎试剂作为试验；考虑的时候还要考虑稀释倍数，稀释倍数越大，试验数据越不可靠。

所以本次检测选用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂做为检测试剂，稀释倍数最大为40倍。

名称厂家规格标志效价数量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24支CSE安度斯10EU/支10EU/支1瓶BET水安度斯5ml/瓶<0.003EU/ml10瓶本文档共67页；当前第57页；编辑于星期一\18点49分溶液AS4S8S16S32S40各2支溶液B

S4E2λ

S8E2λS16E2λ

S32E2λS40E2λ各2支溶液C

E2λ

各2支溶液DW各2支C、各反应溶液的制备；①溶液C的制备

本文档共67页；当前第58页；编辑于星期一\18点49分②溶液A的制备

1.4ml1.4ml