单基因遗传病的研究策略

关于单基因遗传病的研究策略第1页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三如果一种遗传病的发病仅仅涉及到一个基因，这个基因称为主基因(majorgene)，其导致的疾病称为单基因病。单基因遗传病第2页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三单基因遗传病发病的复杂性外显率：一定基因型个体表现出疾病表型的比例表现度：相同基因型不同个体在疾病表现程度的差异基因多效性：一个基因有多种生物学效应遗传异质性：表型相似而基因型不同的现象从性遗传和限性遗传：常染色体上的基因在不同的性别有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布上的差异遗传早现现象：疾病在世代中存在发病年龄逐渐提前或病情逐代加重的情况第3页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三研究策略与方法临床诊断、家系调查与材料收集侯选基因的确定已知致病基因突变位点的确定连锁分析与未知基因的基因定位基因型与表现型相关性研究发病机制的研究第4页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三临床诊断、家系调查与材料收集第5页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三临床诊断查阅相关资料，认识不同遗传病患者临床表现及其辅助诊断措施临床诊断：症状和体征常规辅助检测指标特殊诊断指标第6页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三家系调查与系谱分析调查家系三代以上所有相关成员的信息根据调查资料，用系谱中常用的符号绘制成系谱系谱分析：区别遗传病与非遗传病区别单基因与多基因病判断遗传方式第7页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三大家系第8页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三散发病例第9页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三临床遗传病家系特点散发病例：对于遗传病，包括单基因遗传病，多数病例表现为散发。小家系病例：在有家族史的病例中，多数也是小家系。大家系病例：极少数家系发病个体多，涉及3-4代都有患者。第10页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三收集材料采集样品：

外周血，颊粘膜脱落细胞，毛囊,

病人组织（如可以取材），羊水（产前诊断）采集家系应做到尽可能完整患者、同一家系中有相同遗传背景的表型正常的其他个体、该家系中其他遗传背景的成员第11页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三收集临床资料病人临床上一系列指标的检测保存相关信息和影象资料病人血清或组织的保存及其酶、病理或免疫学研究第12页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三侯选基因的确定第13页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三文献检索数据库

中的OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）数据库中整合了目前已定位的单基因病的信息确定自己所研究家系的可能已知候选基因或已定位的染色体候选区域第14页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三根据疾病名称检索第15页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三根据基因检索第16页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三检索最新文献第17页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三确定已知致病基因突变第18页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三获得已知基因基因组序列设计引物或参考文献中引物根据文献，采用合适的技术方法进行基因突变分析（在后面课程中详细介绍）从数据库中查阅目的基因的相关信息第19页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三

PCR-测序分析MFN2基因结果发现错义突变:c.281

G>A,其所在密码子由CGG变为CAG,导致其编码氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺.结论：经查阅文献资料，c.281

G>A为已知致病突变位点，可判断其为该患者的致病突变位点。

第20页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三根据变异导致的结果判断根据突变数据库和文献资料排除已知SNP根据家系共分离与否判断在正常对照人群中分析保守性分析基因功能分析突变分析结果的判断第21页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三连锁分析与未知基因的基因定位第22页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三

利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。连锁分析注：适于分析较大的遗传病家系，不适于散发病例和小家系病例第23页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三连锁

重组第24页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三遗传标记进行连锁分析时需要的一些已知遗传位点，这些位点应按孟德尔方式遗传，且具有多态性以便显示连锁关系，这些标记位点称为遗传标记RFLP，STR,SNP第25页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三连锁分析结果第26页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三连锁分析结果第27页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三基因定位：将致病基因确定到染色体的实际位置未知致病基因定位克隆研究基因克隆：确定致病基因第28页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三定位克隆基本方法和步骤收集家系，选择遗传标记进行连锁分析，对目的基因作图定位确定候选位置，对目的基因进行精细定位从候选基因中确定正确的基因（二代测序技术）第29页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三例：一个X连锁肌肉病家系致病基因的定位克隆研究

第30页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三家系情况及前期研究基础先证者Ⅲ2临床表现近似DMD排除了DMD/EMD/FHL1基因突变第31页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三研究策略全基因组90万个SNP位点；8例样本；商业公司完成选取数个SNP点；增加3个成员连锁区域内的基因：MapViewer；基因表达：UniGene数据库及HGNC网站；基因功能：OMIM数据库1例样本(I2)；商业公司完成第32页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三SNP芯片数据分析

连锁分析提示X染色体有三段连锁区域：第33页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三单体型分析第34页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三

GenemaplocusGRCh37.p5PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)GeneticMap(Marshfield)(cM)

Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49

Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62

Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段连锁区域第35页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三精细定位分析将Xp22.32-p22.2连锁区域由6.78Mb缩短为4.18Mb

第36页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三排除Xp21.2-p21.1连锁区域第37页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三肯定Xq24-q27.2连锁区域第38页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三最终确定两段连锁区域GenemaplocusGRCh37.p5PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06

第39页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三连锁区域内包含的基因Xp22.32-p22.2连锁区域共28个基因：14个已知基因,14个预测基因14个已知基因：6个基因在肌肉组织中表达（3个基因表型已知，均与肌肉病无关）7个基因不在肌肉组织表达1个基因表达情况未知

第40页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三Xq24-q27.2连锁区域共272个基因：122个已知基因,150个未知基因122个已知基因：79个基因在肌肉组织中表达（18个基因表型已知，其中包括前期已经排除的FHL1基因）41个基因不在肌肉组织表达2个基因表达情况不清楚

第41页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三外显子组测序平均覆盖度：23.8×；覆盖度大于>20×位点占53.7%在上述两个连锁区域测序深度均很低对测序深度>20的变异位点进行验证，结果均无变异第42页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三存在的问题及解决办法本家系患者未进行肌肉活检将进行多个样本的外显子组测序第43页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三Genotype和Phenotype相关性研究第44页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三例：非综合征型先天缺牙的分子遗传学研究

JDentRes,2009;88:126-131EurJMedGenet,2008;51:536-546EurJMedGenet,2011;54:377-382第45页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三单基因遗传病发病机制的研究第46页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三——隐性突变往往导致失去功能（lossoffunction）——显性突变可导致获得功能（gainoffunction）和失去功能失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency）获得功能：显性负效应（dominantnegtive）

隐性突变和显性突变的致病机制第47页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三Gainoffunction：

Loricrin基因突变获得核转位的新功能

BrJDermatol,2008;159:714-719

第48页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三Loricrin角皮病第49页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三连锁分析与1q21区域连锁第50页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三发现Loricrin基因新突变第51页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三特殊的临床表现第52页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三突变蛋白序列新功能的预测第53页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三GFP表达载体的构建第54页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三细胞亚定位分析第55页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三动物模型过表达和基因敲除小鼠模型均表现正常表型转基因小鼠表现出与人类疾病相似的疾病表型，提示突变基因获得功能为其发病机制。第56页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三基因敲除小鼠表型基本正常第57页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三转基因小鼠表型与人类疾病相似第58页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三结论

Loricrin基因突变可引起新的疾病表型Loricrin突变蛋白获得新功能，通过其核定位信号介导了突变蛋白的核转位第59页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三Haploinsufficiency：

PAX6基因单倍剂量不足影响胰岛素成熟过程导致糖耐受异常

Diabetologia.2009;52:504-13第60页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三先天性无虹膜家系第61页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三在该家系发现

PAX6突变(c.1080C>T)导致单倍剂量不足

SSCPanalysis

DNAsequencing

第62页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三Tonetal.Cell67,1991PAX6

基因及其cDNA第63页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三Essentialforthedevelopmentoftheeye&brain

homozygous

mutants—noeyes,nobrain,die

heterozygousmutants—smalleyesinmiceaniridiainhumansEssentialforthedevelopmentofpancreas

homozygous

mutants—abnormalpancreaticstructurePAX6的功能Hilletal.Nature354,1991;St-Ongeetal.Nature387,1997;Sanderetal.GenesDev11,1997第64页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三PAX6在胰腺发育中的功能Mansourietal.TEM10,1999Dohrmannetal.MechDev92,2000第65页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三

PAX6在成体胰腺中的功能Homozygousmicewithconditionalk/oPAX6inthepancreascauseddiabetes

FouraniridiapatientswithPAX6mutationswerereportedtosufferfromglucoseintolerance

Ashery-Padanetal.DevBiol269,2004Yasudaetal.Diabetes51,2002

第66页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三假说PAX6mutation?abnormalglucosehomeostasis第67页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三OGTTAnalysisintheAniridiaPedigreeIDAgeBMI(kgm-2)Glucoselevels(mmolL-1)ClinicalstatusAniridiaGenotype0’120’

Ⅱ-6Ⅱ-7Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-5Ⅲ-6Ⅲ-8Ⅲ-9Ⅲ-10Ⅲ-11Ⅲ-13706850434133304038363217.5820.2217.8820.8621.1520.4220.9920.4320.9622.9320.834.554.084.865.253.694.274.916.055.277.744.668.0412.9911.418.657.806.625.8814.579.7815.617.31IGTDDIGTIGTNGTNGTDIGTDIGT+++++++++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅣ-1Ⅳ-2Ⅳ-5Ⅳ-7Ⅳ-9171811161419.4120.3315.2819.4116.194.173.984.725.144.587.956.855.666.217.07IGTNGTNGTNGTNGT+

++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅢ-15Ⅲ-16Ⅲ-17Ⅲ-18Ⅲ-19Ⅳ-3Ⅳ-4Ⅳ-6Ⅳ-84138343330151171219.9321.1922.3020.4322.8317.3115.4215.0616.544.414.894.254.014.384.155.244.814.716.765.335.036.006.635.485.086.186.23NGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGT---------N/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/N第68页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三血糖和胰岛素水平第69页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三总结1AniridiacausedbyPAX6genemutationPAX6mutationcausedimpairedglucosetolerance(IGT)PAX6-relatedIGTwasassociatedwithage第70页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三问题DoesIGTcomefromdeficiencyofinsulin?Dothesepatientshaveinsulinresistance?Dopatientshaveadefectininsulinprocessing?

第71页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三PAX6HadNoEffectontheTranscriptionalActivityofthe