动物微生物病毒感染的实验诊断

关于动物微生物病毒感染的实验诊断第1页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。第2页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三1.对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。第3页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三2.对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。第4页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三3.对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。第5页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三4.对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原体。第6页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三5.对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体，6.对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。第7页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三第一节标本采集与运送

一、标本的采集1.采样时间尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。

第8页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三2.标本种类的选择根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。第9页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三常见分离病毒标本的选择

病毒咽拭子粪便血液脑脊液唾液

组织

柯萨奇A和B组

+++心

单纯疱疹病毒

+脑膜

腮腺炎病毒

+++流感病毒

+轮状病毒

+HAV+HIV+精液第10页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三3．常见标本的采集方法

(1)血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。第11页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(2)脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml，冰浴立即送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。第12页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(3)宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离HSV、CMV。第13页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(4)粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。第14页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(5)含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。

第15页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(6)喉拭子：用压舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMV、肠道病毒、HSV、流感病毒等。第16页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸人尿道4cm转动3次，以获得较多的上皮细胞，用于分离CMV和HSV。(8)尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分别使用器械和容器。第17页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三二、标本的运送和保存

病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，用于分离培养的标本要尽快送检，4℃下数ｈ或-70℃。冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作保护。第18页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三病毒传送培养基以Hanks液为基础加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml，为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。第19页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三第二节病毒分离与鉴定

一、病毒的分离方法1.组织细胞培养根据细胞的来源、特性和传代次数分为：(1)原代细胞培养：将细胞悬液。加入营养液培养。形成的单层细胞，称之为原代细胞。第20页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(2)二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。寿命一般为40～50代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。第21页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。第22页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三2．鸡胚接种鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。第23页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三3．动物接种动物对病毒的敏感性是不同的，选择合适动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。第24页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三常用于病毒分离的细胞

细胞种类可分离的病毒

原代细胞非洲绿猴肾细胞人单核细胞人胚肾、肺细胞恒河猴猕猴肾细胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒

HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、RSV二倍体细胞株人胚肺成纤维细胞株WI-38、MRC—5CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒传代细胞系

HelaHep-2Vero

柯萨奇A、B组、RSV腺病毒、RSVHSV、RSV、风疹病毒、轮状病毒、麻疹病毒第25页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三三、病毒的鉴定

必须通过全面了解其特性才能得到鉴定。1.根据临床特点，流行病学资料，标本来源，大致了解病毒的一些特性，有助于确认病毒的种类。第26页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三2.动物感染范围及特点病毒感染动物的范围、发病的潜伏期。3.细胞培养特点。综合上述资料作出鉴定。第27页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三病毒鉴定的方法1.细胞培养的结果观察

病毒增殖后导致细胞发生:①细胞病变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；第28页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三②不出现细胞病变现象。③细胞培养液pH的变化。第29页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三2.中和试验病毒与特异性抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养和活的机体内不出现病变的试验。常用细胞培养进行中和试验。如果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体的同型病毒，第30页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三用于病毒的分型诊断最具敏感和准确性。也可用于检查患者病后或人工免疫后，机体血清中抗体增加情况。

第31页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三3.空斑或蚀斑形成试验

空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定。第32页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三4.干扰现象

某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附作用。第33页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三5.红细胞吸附及吸附抑制试验正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。第34页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三可作为初步鉴定。如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据。第35页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三4．血凝试验及血凝抑制试验

某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可抑制血凝现象的发生，是为血凝抑制试验。可作为病毒型别确定的依据。第36页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三5．病毒的大小及形态

可用电子显微镜观察病毒的大小及形态。第37页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三6．核酸类型鉴别及序列测定利用5—溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。第38页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定或DNA杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。第39页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三7．耐酸试验

肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。

第40页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三8．乙醚敏感试验

病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。

第41页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三9．免疫荧光抗体染色

将感染细胞固定，用特异抗血清荧光标记染色，在荧光显微镜下，可见细胞内荧光，即可确定型别。第42页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三第三节病毒感染快速诊断

通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态、特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认病毒的感染，是病毒学诊断的重大发展。第43页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三一、形态学检查

1．光学显微镜观察病毒感染细胞出现的包涵体。根据特点可作出辅助诊断。狂犬病病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或椭圆形包涵体，称为内基小体。巨细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样大型嗜酸性包涵体。第44页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三2．电子显微镜检查(1)电镜直接检查：早期病毒感染标本的病毒颗粒。如“秋季泻”患儿粪便中的轮状病毒、甲肝患者粪便中的HAV，疱疹病毒的疱疹液，HBV患者血清，均可观察到特征性病毒颗粒。

第45页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三(2)免疫电镜检查：在标本中加入抗体。使病毒聚集成块负染观察，更易发现病毒体，灵敏度可提高100倍。第46页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三

二、病毒抗原检测

病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。第47页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三1．免疫荧光技术适合于型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检组织中的肝炎病毒、神经组织中的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂犬病毒或其他脱落细胞和活检组织中的病毒抗原检测。第48页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三2．酶免疫技术有酶免疫组化和酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测定标本中游离的抗原或抗体。如检测乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗体等。第49页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三3.其他技术如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。第50页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三三、早期抗体检测

检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性IgM可以快速明确诊断各种病毒引起的新生儿先天性感染，测定HAV感染后抗HAV的IgM抗体可以明确诊断HA等。第51页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三四、病毒核酸检测只要有完整的特异基因片段存在，就可进行诊断。第52页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三1．斑点杂交法

将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用32p或131I同位素标记的探针通过放射白显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。第53页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三2．固相杂交技术

将核酸探针包被聚苯乙烯微孔板中，加人待测的核酸序列和标记的指示探针杂交液中进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。第54页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三3.原位分子杂交技术

在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。通过显色技术可显示特定杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。第55页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三4.Southern印迹和Northern印迹法

Southern印迹法用于DNA的杂交。提取DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以检测病毒DNA特异序列。Northern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。第56页，讲稿共63页，2023年5月2日，星期三5．聚合酶链反应(PCR)

选择病毒的特异保守片段作为靶基