免疫分析及免疫传感器

关于免疫分析及免疫传感器第1页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.1引言临床、生物电化学及环境分析物的检测需要快速、简便的分析方法基于抗体-抗原相互作用的免疫分析及免疫传感器由于其特异性及灵敏性显示良好的前景抗体与被分析物（通常指抗原）在免疫分析体系或免疫传感器界面形成稳定的复合物，通过分子识别达到高度的特异性灵敏度取决于以下几个方面：采用与分析物高亲和性特异结合的抗体；抗体在免疫分析或免疫传感器界面的固定排列方式；合适的信号检测系统第2页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三放射免疫分析：放射活性物半衰期短、损害健康、污物难处理等光学免疫分析：对于有色样品及不纯样品检测的灵敏性有一定限制电化学免疫分析及免疫传感器：快速、简便、经济等特点，微型化，均相检测第3页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三本章主要介绍一些基础背景知识，包括抗体结构和抗体-抗原相互作用，这对所有采用特殊的免疫分析模式的免疫分析和免疫传感器来说，都是至关重要的因素。重点介绍电化学免疫分析和免疫传感器的发展现状，以便能够比较容易地理解该领域取得的成就，并加以应用。第4页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

4.2抗体-抗原相互作用免疫分析和免疫传感器都是通过抗体对抗原的特异性分子识别来进行分析的系统。抗体是一类称为免疫球蛋白（Ig）的糖蛋白，通常分为5类（IgA、IgG、IgM、IgD、IgE），其中IgG是最主要的成分（约占70%），经常用于免疫分析技术中。第5页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三抗体分类

根据重链C区氨基酸组成及排列顺序不同抗体可分为五类第6页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三L链L链H链H链N端C端四肽链结构

链间二硫键连接，呈“Y”形两条相同的重链和两条相同的轻链上部为N端，下部为C端第7页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三根据氨基酸排列顺序的不同分为：可变区(VariableRegion）和恒定区（ConstantRegion）可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较大恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定可变区与恒定区第8页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三铰链区根据氨基酸序列的可变性，可分为恒定区（C区）和可变区（V区）第9页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.1抗体Y型结构示意图。介于重链和轻链之间的区域即为抗原结合区域，“Y”型的开臂部分记为F(ab')2,而底部无抗原结合活性的区域记为Fc。第10页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三其中，K为反应平衡时的速率常数；Ab-Ag为抗体-抗原复合物。K的范围为106~1012Lmol-1，通常只有亲和常数K较大的抗体（≥108Lmol-1）显示较低的交叉反应性。抗体（Ab）-抗原（Ag）的结合遵循以下平衡方程：这些性质使得许多抗体成为免疫分析及生物传感器设计中理想的生物识别成分。第11页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

单克隆抗体特别适用于免疫分析。单克隆抗体是由单一细胞系合成的，因此具有相同的抗原决定簇特异性和亲和性，是可以大量制备的均质抗体。与多克隆抗体相比，单克隆抗体显示更高的特异性和均质性，可减少纯化步骤。第12页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三第13页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.3免疫分析及免疫传感器免疫分析是一种利用抗体作为待测抗原（通常为被分析物）的主要结合试剂来进行定量分析的方法。免疫分析的最终结果通常是研究抗体-抗原之间的结合，以及游离抗原与抗原-抗体复合物之间的识别。所有的免疫分析都是基于测定识别位点的结合率，即测定结合位点数或间接测定未结合位点数。第14页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三免疫分析基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段；免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。第15页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三免疫的原理Ag+AbAg－Ab

特异性、灵敏性在Ag，Ab反应中，用容易示踪的化学物质标记一种反应物，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生的程度（即对未知成分的样品进行定性、定位及定量分析）。第16页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三免疫学检测历史演进放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院）；酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）；以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。第17页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.3.1酶联免疫法免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。第18页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两个方面：免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记，与抗原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。酶联免疫吸附法（ELISA)：根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。第19页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ELISA的基本原理和方法ELISA的种类和变化ELISA的特点ELISA的应用实例ELISA第20页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.3.1.1基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）第21页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。第22页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。

这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。

其方法简单，方便迅速，特异性强。第23页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.3.1.2酶及其底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应。第24页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲基联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

第25页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.3.1.3ELISA的种类和变化

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）捕获法测IgM抗体重点第26页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三（一）双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：

二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等第27页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三步骤：A将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；B加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗；C加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；D加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。第28页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三第29页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-EEEEEEEEE第30页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三（二）间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用

常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定第31页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三步骤：A将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；B加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗；C加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗；D加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。第32页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三第33页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-EEEEEEEEE+第34页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三（三）竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）第35页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三步骤：A将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；B将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；C加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。第36页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三第37页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三洗涤洗涤竞争法测抗原+-EEEEEEE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合E第38页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。第39页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

应用：

病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体（四）捕获法第40页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三捕获法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

第41页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EEEEE

1、固相化抗人IgM1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色第42页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.3.2竞争性免疫分析体系

图4.2竞争性免疫分析示意图将样品与已标记待测物混合后再去竞争有限的抗体结合位点标记复合物产生的信号与样品中待测物的量成反比关系

第43页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三基于竞争免疫分析的免疫传感器用来检测小分子物质雌二醇

图4.3竞争免疫分析检测雌二醇的结构示意图第44页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三E.Zacco,R.Galve,M.P.Marco,S.Alegret,M.I.Pividori,Biosens.

Bioelectron.22(2007)1707.Fig.6.SchematicrepresentationoftheelectrochemicalcompetitiveimmunosensingstrategyforthedetectionofatrazineinorangejuicewithProtA-GEB-basedbiosensors,showingtheimmobilization(AandB)andthecompetitiveimmunologicalreaction(C).第45页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三竞争性电化学免疫分析和免疫传感器还广泛应用于重要的临床分析物的检测。尽管竞争免疫分析比较简单，但其缺点在于待测物标记后与抗体的结合能力可能减低甚至消失，特别是当标记物靠近抗原决定簇时，此现象尤为突出。

第46页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三非竞争性免疫分析体系（即双抗体夹心免疫分析）通过过量的抗体与抗原反应，使抗原与样品溶液分离，形成的免疫复合物再与过量的信号二抗反应，其中二抗只特异性地与固定的抗体-抗原复合物结合。

4.3.3非竞争性免疫分析体系

非竞争性免疫分析（b）示意图第47页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三通常需要加入封闭剂减少非特异性反应当检测体系中信号抗体的量过多时也应考虑非特异性吸附问题该法特异性强，但只适用于两个抗原决定簇能够同时被识别的待测物的定量分析

第48页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三利用非竞争性免疫分析体系检测食品中的致病菌

图4.4流动免疫传感器的示意图。（1）液体进口，（2）碳集电器，（3）可弃免疫柱，（4）高度分散的抗体修饰的碳颗粒（免疫吸附剂），（5）碳对电极，（6）Ag/AgCl参比电极，（7）液体出口。

对斯特杆菌的检测限为10cellmL-1，线性范围10~1500cellmL-1。

第49页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.4抗体固定模式

捕获抗体在固相表面的固定方式是一个关键的问题比较理想的固定方法是所固定的捕获抗体以空间位阻最小的方式排列，易于与目标抗原反应抗体固定后与抗原的结合能力没有明显改变这些性质与免疫体系所能达到的灵敏度和动力学范围有直接关系抗体固定技术：共价键合法、物理吸附法、聚合物静电/物理包埋法

第50页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.4.1生物素-（链霉）亲和素相互作用

生物素-亲和素系统(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。多级放大效应-灵敏生物素与亲和素之间高度亲和力-特异稳定适用性强（与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合）第51页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.5两种免疫传感器的示意图：（a）基于生物素-链霉亲和素相互作用的免疫传感器；(b)基于兔IgG修饰的SPCE的免疫传感器。

兔抗鼠抗体鼠抗体第52页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三利用蛋白A-环氧石墨生物复合体进行免疫分析，激光诱导荧光显微镜检测RIgG。第53页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.4.2抗体结合蛋白质

细菌抗体结合蛋白质是免疫分析中另一种基于亲和作用的抗体固定技术，最常用的是蛋白质A和蛋白质G。特异地与抗体的非抗原结合区域（Fc）作用，使抗体的抗原结合位点远离固定相表面，易于与待测物反应。均可以直接与抗体的Fc部位结合，不需要对抗体进行生物素化修饰。蛋白质A的分子量约为42kDa，最初是从金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）的细胞壁中分离出的。第54页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.6以蛋白质A-GBE为转换器的免疫传感器示意图。（a）通过与蛋白质A作用固定RIgG，（b）抗RIgG抗体和生物素标记的抗RIgG抗体的竞争免疫反应，（c）通过链霉亲和素-HRP标记酶，（d）电化学检测酶活性。检测抗RIgG抗体的范围为2pmol-10pmol

第55页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三以蛋白质A修饰的石墨环氧树脂生物复合物（ProteinA-GBE）为刚性支架，不但可以固定抗体，还可作为电化学信号的转换器。生物复合材料膜的制备：将石墨粉与环氧树脂按质量比1׃4的比例混合，再加入蛋白质A使其最终浓度为2%（W/W），得糊状物。将糊状物装入带有电气插头的圆柱型模具，压实，保持一星期。通过在Al2O3纸上研磨抛光，形成光滑的镜面，使蛋白质A露于表面，蛋白质A-石墨环氧树脂膜还可以重复使用。第56页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三5.4.3导电聚合物

导电聚合物，如聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩等，已广泛应用于免疫分析体系中捕获抗体的固定，可用于电流型、电位型及阻抗型免疫分析体系。导电聚合物可以在酶和电极表面之间提供一条电子转移通道，而不需要介质来传递电子。利用导电高分子容易实现“无试剂”或“无标记”免疫传感器。利用导电聚合物固定抗体的方法通常是将抗体包埋于聚合链中。利用含有抗体的单体溶液，抗体和聚合物可以同时固定在传感器表面。然而包埋法可能使抗体变性，失去活性。而且大部分的抗体包埋于聚合物基底中，不能与抗原结合。另一种方法是先将导电聚合物膜修饰到电极上，利用其活性基团共价键合抗体。第57页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.7基于TTCA膜的电极制备及信号产生示意图Darain等报道了一种基于聚(三噻吩羧酸酯)（TTCA）修饰丝网印刷碳阵列（SPCA）的电流型免疫传感器，用于检测前体蛋白卵黄原蛋白（Vtg）。

竞争免疫分析第58页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.4.4自组装单层膜

自组装单层膜（SAMs）是免疫分析体系中另一种抗体固定方法。利用烷烃硫醇与Au、Ag等金属的固有化学吸附性可形成高度有序的单层膜。Au电极由于不受周围环境影响发生氧化反应而常被用作工作电极。第59页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三首先烷烃硫醇通过Au-S键在Au电极表面形成烷烃硫醇自组装单层膜。目前被普遍接受的解释Au-S键形成的模式是，第一步S-H键氧化加成到Au表面，还原消除氢，见方程（2）所示。图4.8烷烃硫醇链在SAM修饰的金电极表面形成的20°-30°倾斜角的示意图ω-碳取代的烷烃硫醇形成的SAM表面包含游离的羧基，活化后可与捕获抗体或其它蛋白质的赖氨酸上的氨基共价结合。第60页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三抗体除了可以通过共价键结合到SAM上，还可以通过静电作用结合到带电的SAM膜上。

IgG通过“头部”吸附到带有-COOH的SAM上，而以“尾部”和“侧面”两种方式吸附到带有-NH2端基的SAM上。S.Chen,L.Liu,J.Zhou,Langmuir,2003,19,2859-2864研究了不同表面和溶液性质对抗体吸附排列方式的影响

第61页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三5.4.5抗体片段

抗体的片段化可以通过糜蛋白酶、胰岛素、木瓜蛋白酶等蛋白水解酶催化完成。酶降解后，用以连接所生成的两条F(ab')2链的二硫键可以被二硫苏糖醇或２-巯基乙胺等试剂还原，而生成两个Fab'片段。每个片段末端都带有硫基，所以与金表面有很高的亲和性，不需另外加试剂就可自组装到金表面。形成的SAM呈有序排列，抗原结合区域很容易与抗原结合。L链L链H链H链N端C端第62页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三Zhang和Meyerhoff报道了一种基于Fab'片段固定于包被金的磁性粒子上的免疫分析方法，用于检测C活性蛋白（CRP）Anal.Chem.2006,78,609-616甲苯磺酰基第63页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三Figure2.SEMimagesof(A)M-500(4.5-ímdiameter)uncoatedmagneticparticlesand(B)gold-coatedM-500magneticparticles.第64页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三将包被金的磁珠与抗CRPFab‘片段于4°C孵育过夜，抗CRPFab’片段固定于磁珠表面，然后与不同的CRP反应，以吸光度对CRP浓度做工作曲线，检测限可达到0.14ngmL-1。通过Fab'片段上的氨基与未包被的磁珠发生甲苯磺酰基反应共价键合的，检测限为1.9ngmL-1。

第65页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.5化学发光检测技术发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。

第66页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三請你們猜一道謎題：夜晚不休息，提燈四處巡，明滅草叢間，好似點點星。猜一種昆蟲螢火蟲公佈謎底螢火蟲為什麼會發光？是由身體哪個部位發光的？吃什麼東西？哪個地方看得到螢火蟲？這些問題，在接下來的投影片中都有提到，請仔細聆聽喔！START第67页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三萤火虫发光雄螢雌螢〈身形較大〉第68页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三神奇的海底你知道吗？海面上波涛汹涌的时候，海底依然很宁静。最大的风浪，也只能影响到海面一下几十米深。阳光射不到海底，水越深光线越暗。五百米以下就全黑了。在这片黑暗的深海粒，却有许多光点像闪烁的星星，那是有发光器的深海鱼在游动。海底真是个景色奇异，物产丰富的世界。海底剪辑点击海底剪辑，会让你一饱眼福！美丽的图片深海鱼发光第69页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三神奇的海底海底动物第70页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三发光分类光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。化学发光根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:第71页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三化学发光

Chemiluminescence(CL)化学发光是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。第72页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

化学发光反应包括两个关键步骤，即化学激发和发光。化学发光反应能级图第73页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A十BC*C*C＋h·γ其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。

第74页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ第75页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

化学发光分析根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，称为化学发光分析。第76页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三化学发光分析优点化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响，有很高的灵敏度，并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。第77页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三化学发光分析缺点虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。第78页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三化学发光免疫分析

chemiluminescenceimmunoassay（CLIA）CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。

第79页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三化学发光免疫分析（CLIA）分类按分离方法不同分微粒子化学发光免疫测定磁颗粒化学发光免疫测定第80页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。

4.5.1化学发光剂第81页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三能作为化学发光剂的条件：①发光的量子产率高；②它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应的结果；⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。第82页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三㈠直接化学发光剂

直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。

第83页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

1.吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。

第84页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三2．三联吡啶钌

三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌第85页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三㈡酶促反应发光剂：是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。1．鲁米诺及其衍生物

2．AMPPD第86页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三1．鲁米诺图4.9鲁米诺发光原理第87页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.10鲁米诺增强发光反应原理第88页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕第89页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三1.碳二亚胺（EDC）缩合法

4.5.2发光剂的标记技术第90页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三2.过碘酸钠氧化法

第91页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三3．重氮盐偶联法第92页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法

第93页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

1．发光剂的选择2．被标记蛋白质的性质3．标记方法的选择4．原料比5．标记率6．温度7．纯化与保存影响标记的因素第94页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三

用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。4.5.3直接化学发光免疫分析第95页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后---夹心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）直接化学发光的机理第96页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特点抗原和抗体结合与未结合部分易分离磁微粒技术第97页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。4.5.4化学发光酶免疫分析第98页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。㈠辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析第99页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.11辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图

第100页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。

㈡碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析第101页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.12碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图

第102页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三分析步骤分配样品,磁颗粒和试剂孵育使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入底物产生信号孵育,促使信号的产生信号检测第103页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.6电致化学发光（ECL)电致化学发光(ECL)是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。第104页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三电致化学发光（ECL)ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活性。第105页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.6.1电化学发光剂定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。特点反应在电极进行化学发光剂：三联吡啶钌电子供体为：三丙胺（TPA）第106页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三三联毗啶钌分子结构图第107页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三三联吡啶钌

（[Ru(bpy)3]2+）特点ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作为标记物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羟基琥珀酸胺酯（NHS），该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。第108页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三三联吡啶钌（[Ru(bpy)3]2+）特点[Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性；[Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小，即便小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大大丰富，更重要的是为其检测菜单的开发前景提供了广阔空间。第109页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三电化学发光原理图基态激发态不稳定二丙胺+丙醛第110页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.6.2电化学发光免疫分析

(Electro-ChemiluminescenceImmunoassay,ECLI)ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一代标记免疫测定技术；ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物；ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。第111页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ECLI原理在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。第112页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.13电化学发光免疫分析示意图第113页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.14电化学发光免疫测定示意图第114页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.15标记磁颗粒在电场中发光工作示意图第115页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）第116页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ECLIA检测流程图二（生物素与亲和素结合）第117页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ECLIA体系结构图第118页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ECLIA检测流程图三（磁珠吸引吸附于电极表面）第119页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ECLIA检测流程图四（电极充电启动电化学反应）第120页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ECLIA检测流程图五（撤消磁场冲洗磁珠）第121页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三方法评价采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8μm的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快；第122页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三方法评价“链霉亲和素-生物素”是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高；第123页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三方法评价利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化；标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。第124页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三基于CdS量子点-CNT-AuNP-壳聚糖的电致化学发光免疫传感器研究第125页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三PDCNT：聚乙二胺-CNT第126页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三Fig.1.(A)ECL-timecurvesof(a)PDCNTs/Auelectrode,(b)CdSQDs/Auelectrode,and(c)CdSQDs-PDCNTs/Auelectrode.(B)ECL–potentialcurveandcyclicvoltammogram(inset)ofCdSQDs-PDCNTs/Auelectrode(PMT:600V).第127页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ECL–potentialcurvesof(a)PDCNTs,(b)(a)+CdSQDs,(c)(b)+GNPs-CHIT,(d)(c)+Ab,and(e)(d)+HIgGmodifiedAuelectrodes(PMT:600V),andECLemissionfromtheimmunosensorfor34cycles(inset)(PMT:800V).第128页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三RepresentativeSEMimagesof(A)PDCNTs,(B)(A)+CdSQDs,(C)(B)+GNPs-CHIT,(D)(C)+AbmodifiedAuelectrodes.第129页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三Fig.3.ECLresponsesoftheimmunosensorwithdifferentconcentrationsofHIgG(a–h).HIgGconcentration(ngmL-1):(a)0,(b)0.006,(c)0.06,(d)0.6,(e)3,(f)6,(g)60,and(h)150.(Inset)CalibrationcurveforHIgGdetermination.第130页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三ELIA优越性高度敏感，可达pg／ml或pmol水平；特异性强，重复性好，CV＜5％。测定范围宽，可达7个数量级。试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。操作简单，耗时短，易于自动化。在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。第131页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三临床应用激素肿瘤标记物内分泌功能传染性疾病其它如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。

第132页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.7电化学检测技术

电化学检测由于其自身的优点常用于生物传感器研究，成为免疫传感器中研究最早、种类最多、也较为成熟的一个分支。

电化学转换的高灵敏性易与现代微型化/微加工技术兼容较低的能源需求不受样品的浊度及颜色的影响

第133页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三电化学免疫传感器的基本工作原理是：采用电化学检测方法来检测标记的免疫试剂或者一些由酶、金属离子和其他电活性物质标记的标记物，从而对疾病诊断或病人状态监测中复杂体系的多组分混合物进行分析，提供有力数据。根据信号的类型可分为电位法、电流法、伏安法以及最近发展的电化学阻抗检测第134页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.7.1电位型免疫传感器

电位型免疫传感器是基于测量抗体、抗原免疫反应后指示剂与参比电极之间的电位变化来进行免疫分析的。有关基于电位检测的免疫传感器的研究报道较少该检测方法一个主要的缺点就是抗体-抗原发生免疫分析后电位变化不大。而且，样品基底的干扰会使这种小的信号变化难以准确检测，所以电位型传感器的可靠性及灵敏性较差。第135页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三一种电位型免疫传感器，在聚吡咯修饰的丝网印刷电极表面检测酶标免疫复合物首先在含有吡咯单体和十二烷基硫酸钠的溶液中，进行循环伏安扫描至少4次，形成电聚合膜修饰电极。然后在电极上加一恒电位使聚吡咯膜达到其最终状态。所形成的聚吡咯膜修饰电极在37°C时可以保存4个月，而且显示良好的灵敏性。捕获抗体可以通过直接吸附作用固定在聚吡咯膜上，也可以将生物素修饰的抗体结合到链霉亲和素修饰的聚吡咯膜上。然后将电极与含有乙肝表面抗原或心肌肌钙蛋白I的样品溶液孵育，再加入HRP标记的抗体进行夹心式免疫分析。加入活性底物二氯邻苯二胺60s后，在0.01MPBS（pH7.4）中进行电位检测，记录电位。第136页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.7.2电流型免疫传感器

电流检测中，在恒电压下电活性分析物在电极上产生的氧化或还原电流强弱与待测物浓度成正比。由于抗体和抗原本身并没有电化学活性，所以在免疫传感器中需要在免疫复合物中引入合适的标记来形成电化学反应。在这方面，标记酶，包括氧化还原酶、HRP和水解酶AP，由于它们能催化底物生成电活性产物而经常被用到，产物的氧化还原电流与待测物的浓度成正比。

第137页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三AP催化它的底物4-氨基磷酸苯酯（4-APP）生成4-氨基苯酚（4-AP）。生成的4-AP被氧化成4-醌亚胺（4-QI），从而产生法拉第电流，其大小与待测物的浓度成正比。值得注意的是，酶标记最大的优点是，由于催化效果，即使用很少的酶也能得到较大的信号。第138页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三1-萘磷酸酯（1-NP）作为底物，用于电流型免疫传感器检测黄体酮。水解产物4-AP和1-萘酚能够在裸SPCE上产生完美的阳极信号。然而，当电极表面固定上抗体时会减慢4-AP向电极表面的扩散，并且4-AP会与电极表面的聚酚发生反应，污染电极，减小电极的电活性工作面积。相反，抗体的固定却不会阻碍1-萘酚向电极表面的扩散。由于1-NP的这种性质，以及低成本、易得到、高溶解性使得1-NP成为他们工作中首选的AP底物。第139页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三在同样条件下，2-磷酸抗坏血酸（AAP）作为另一种AP底物，水解产物也是4-AP。虽然4-APP和AAP均可作为电流型免疫传感器的底物，由于4-APP的催化反应速度比AAP高6倍，并且检测电位较低（大约200-400mV），通常选用4-APP。值得注意的是，4-APP水解产物特有的较低的检测电位可以减少其它物质的干扰，提高免疫传感器的灵敏性。第140页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三AP常用的底物，包括4-APP、1-NP和磷酸苯酯（PP），它们的水解产物在电极表面均不易扩散。非电活性物质的聚集导致形成聚合物，并且氧化还原可逆性差，使电极钝化。电极钝化反过来影响信号的重现性及可靠性，降低电流响应，在达到稳定的电流信号前信号猝灭。最近发现了一种较新的底物，氢醌二磷酸酯（HQDP），来减少污染的问题。HQDP被AP水解生成对苯二酚（HQ），HQ在电极表面被氧化成苯醌（BQ）。第141页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三通过对AP催化水解HQDP（HQ）、PP和1-NP产物的循环伏安图比较研究表明，HQ产生的峰形较好，且可逆。更重要的是，即使在较高的mM浓度下，循环扫50次后仍未发现明显的电极污染。通过系列的研究表明，HQ的无污染性归因于它的氧化产物不在电极表面聚集，以及HQ在电极-溶液界面良好的扩散性。HQDP作为AP底物的另一个优点是，HQ的氧化峰电流比PP或1-NP产物的氧化峰电流高10倍。总之，在电流型免疫传感器的发展过程中，HQDP是一种合适的、吸引人的、可供选择的AP底物。第142页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三在很多情况下，电流型免疫传感器的设计需要将酶固定在离电极表面较远的位置，或者生物样品中干扰物质的存在要求另外的电子转移方式。这就需要用低分子量的氧化还原活性物质（即介质）在过氧化物酶（通常为HRP或葡萄糖氧化酶）氧化还原中心和工作电极表面之间传递电子。介质的要求：具有很高的电子转移速率，使过氧化物酶的异相电子转移易于进行；具有可逆的异相动力学性质，有较低的再生过电位，在要求的物理条件范围内稳定。第143页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三基于ITO电极检测癌胚抗原(CEA)Fig.1SchematicdiagramoftheCEA/Au-chitosan/ITOimmunosensorfordeterminingtheserumCEAlevelbasedonacompetitiveimmunoassay.第144页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三Fig.2ScanningelectronmicrographsofITOelectrodescoatedwith(a)abareITOelectrodesurface,(b)Au-chitosanand(c)CEA/Au-chitosanmembranes.第145页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三上面介绍的酶催化信号产生过程的缺点是一种非直接检测技术。样品待测物与其特异性抗体反应后如果不洗涤，血清和血浆等生物样品中存在的AP和其它磷酸酶会干扰分析结果。一些HRP底物是致癌物质，所以选择一种安全的底物用于免疫传感器的常规操作非常重要这就使得发展基于电活性物质标记的更直接的检测技术非常有意义。第146页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三二茂铁衍生物是快速、可逆的氧化还原物质，可作为介质用于酶生物传感器。其中，二茂铁甲酸由于其水溶性好，且易通过EDC修饰的末端羧基与IgG结合，经常被用到。施加合适的电压，二茂铁甲酸可被快速氧化而不产生任何中间产物。因而二茂铁甲酸成为一种优良的电活性标记物，用于与生物组分连接，开发一种基于信号直接产生的电化学免疫传感器。第147页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三Hromadova等将有机金属化合物三羰基(ŋ5环戊二烯基)合锰（cymantrene）与BSA结合，作为氧化还原标记物，用电化学阻抗检测有机金属标记物的一电子还原反应。

第148页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.7.3伏安免疫分析

电化学免疫传感器通常是将免疫复合物固定在单根电极上，然后利用免疫复合物的标记物在同一电极上进行检测。最近，在电化学免疫分析中采用交叉梳状阵列（IDA）微电极作为转换器变得比较普遍。简单的IDA设计包括一对交叉梳状的微电极“手指”。当IDA用于伏安分析中的传感电极时，两个相互交叉的梳状电极通常采用不同的电位使电活性物质进行氧化还原循环来检测。第149页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.164-AP和4-QI在IDA电极体系中相邻“手指”之间的氧化还原循环在两个IDA电极中的一个加上氧化电位，使4-AP发生两电子氧化反应，生成4-QI。另一个电极上加较负的电位，4-QI扩散到这个电极上后被还原成4-AP，在下一个相邻的电极上又发生氧化反应。优点是相对于背景电流来说，法拉第电流被放大，从而提高信噪比，降低检测限，提高灵敏度。4-APP4-AP4-QI第150页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三Thomas等利用含有相距1.6μm、2.4μm宽的25对铂微电极作为检测器，用于免疫分析中检测鼠IgG。与单电极检测相比，信号放大了4倍，氧化还原信号产生率为87%，鼠IgG的检测限为3.5fmol。第151页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三4.7.4阻抗免疫分析及免疫传感器

在4.4节介绍了抗体在电极表面不同的固定方法，这是在电化学免疫传感器表面构筑理想的免疫复合物的第一步。通过抗体与抗原之间的特异性分子识别，免疫传感器表面的界面电荷、电容、电阻、质量以及厚度都会发生变化。这就激发了人们的兴趣，根据这些界面变化寻求电化学技术，以定量检测待测物。本节重点讨论电化学阻抗谱（EIS），它是一种有效的方法用以检测免疫复合物修饰电极的性质。第152页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三EIS实验中，在电化学体系中固定的直流电位上施加一个小幅（5~10mV峰间距）正弦波电位信号。根据Ohm定律，通过施加的正弦电位和检测到的正弦电流可以绘制阻抗谱。由于正弦电位和电流无论在大小和相等方面均不同，它们的合成阻抗，Ｚ，对频率（ω）的函数通常用实部（ZRe）和虚部（ZIm）来表示：第153页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三图4.17电化学免疫传感器发生氧化还原反应时界面性质的等效电路图

其中RS指电解质溶液电阻，CdI指双电层电容，Ret指电解质溶液发生氧化还原反应时产生的电荷（或电子）转移阻抗，Zω指大量离子从电解质中运动到电极表面产生的Warburg阻抗。RS和Zω代表溶液的性质，不受免疫复合物在电极表面修饰的影响。CdI和Ret的大小则由电极-电解质界面介电性质和绝缘性质决定。第154页，讲稿共166页，2023年5月2日，星期三对于固定了免疫复合物的电极表面来说，双电层电容包括裸电极的恒定电容（Cbare）和免疫复合物产生的可变电容(Cimmun)，用方程（4）来表示。(4)免疫复合物通常都是非电活性的，它们覆盖在电极表面会降低双电层电容，阻碍电解质溶液中氧化还原探针的界面电子转移动力学。因