第四章 污染物生物效应检测

第一节生物测试及方式一、生物测试

生物测试（Bioassay）指利用生物反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时，所导致的影响或危害。实际上就是用生物去测定污染物的危害。可在分子、细胞、组织、器官、甚至个体和种群多种水平上进行。1本文档共99页；当前第1页；编辑于星期三\14点54分污染物毒性生物测试优点：1)生物测试不需特殊仪器、方法简单。2)可提供污染物的生物毒性，而常规的物理和化学检测只能测定污染物的浓度。3）可测定污染物之间的相互作用,以及它们对生物体的综合效应,而常规的物理和化学检测则做不到。4）还可了解环境因素对污染物毒性的影响。如水体pH、溶氧量、氧化还原电位、水体中有机和元机配位体对污染物毒性的影响等 。

2本文档共99页；当前第2页；编辑于星期三\14点54分生物测试意义：1）研究多种污染物联合作用的生物效应。2）监测环境质量的变化。3）制订环境质量标准。4）对制订排污标准，以及对污染物生态风险评价有重要意义。3本文档共99页；当前第3页；编辑于星期三\14点54分但注意：（1）污染物结构、性质、毒作用机理不同，同一种生物对不同污染物的反应不同。（2）不同生物解毒机制、及能力不同，因而不同生物对相同污染物有不同的反应。（3）不同发育阶段的生物对同种污染物的反应也不同。（4）受污染毒害的经验也会影响生物对有毒污染物的反应。

4本文档共99页；当前第4页；编辑于星期三\14点54分（一）生物测试方式根据不同的研究要求和目的，可进行不同的测试。测试方法多样，有按时间分的、有按试验溶液和气体给予方式分的。1、短期生物测试（Shorttermbioassays）指被测试的生物在短时间内暴露于高浓度的污染物下，测定污染物对生物有机体的影响。例：急性毒性试验，以快速估价污染物的毒性。5本文档共99页；当前第5页；编辑于星期三\14点54分1)测试目的：（1）快速估计污染物的毒性；（2）评价几种毒物的相对毒性；（3）评价不同生物对不同条件如温度、pH的相对敏感性等。主要用于测定半致死浓度(LC50)、或半抑制浓度(IC50)或半效应浓度(EC50)。

2)时间设定：一般小于1周，如一般水蚤类<2d，藻类<3d，鱼类<4d。6本文档共99页；当前第6页；编辑于星期三\14点54分3)测试特点（1）暴露时间短；仅几天。（2）污染物浓度高；（3）一般采用静止式给予有毒溶液或气体。但对于下列情况，应用流动式给药：1）不稳定且易挥发的污染物（浓度会渐低)；2）BOD较高的污水(低O2)；3）代谢速率快的受试生物（产生高的代谢产物如CO2和NH3会影响受试生物的代谢。

7本文档共99页；当前第7页；编辑于星期三\14点54分2、长期生物测试（Longtermbioassays）在低浓度下，受试生物长期被暴露于污染物下的测试，又称全部生活史生物测试，常见有慢性毒性试验。

1）测定目的测定在长期污染下，不造成有害效应的毒物最大浓度，或最大允许毒物浓度（MATC）。测定包括毒物对生物生长、生殖、产卵、孵卵、幼体成活等的影响。8本文档共99页；当前第8页；编辑于星期三\14点54分2）时间确定

（1）对动物而言，需要从一个卵期到下一个卵期或更长的连续测定；（2）对于更小的生物如浮游生物，要持续好几代测试；（3）但对生活史特别长的动物，人们则选择在整个生活史中最敏感的几个阶段测试。如在鱼的发育早期测定，这种测定又称部分生活史生物测试。9本文档共99页；当前第9页；编辑于星期三\14点54分3)长期生物测试要求(1)只能采用流动式染毒性。(2)室内试验条件，如水温、pH、硬度等必需和自然季节变化相符。(3)受试生物的生长、发育规律符合季节变化。

10本文档共99页；当前第10页；编辑于星期三\14点54分3、中期生物测试（Intermediatetermbioassays）（1）目的:

介于短期和长期之间的一类生物测试。如亚慢性毒性试验。对毒物的毒作用、靶器官和最大无作用剂量或中毒阈值作出估计。（2）测试时间：8天之内算是短期，8-90天之间中期。（3）毒物给予方式：无论毒物是溶液还是气体，给予方式一般采用流动式，少数可采用静止式。11本文档共99页；当前第11页；编辑于星期三\14点54分（二）受试生物的选择1）对毒物敏感性：SO2的敏感植物：紫苜蓿、大麦、棉花、小麦、三叶草、甜菜、莴苣、大豆、向日葵。O3敏感植物：烟草、番茄、矮牵牛、菠菜、土豆、燕麦、丁香、秋海棠、女贞、梓树。2）具生态学价值或经济价值。3）实验室内易培养和繁殖。4）具清楚的生物学背景资料如生活史、生长、发育特点等；5）足够的数量。6）对毒物的反应的易测性。此外，个体大小、生活史长短，以及以前受污染情况也需考虑。12本文档共99页；当前第12页；编辑于星期三\14点54分二、生物测试标准化（一）影响生物测试的因素

1、受试生物：受试生物的种类、生长年龄（生活阶段、尺寸大小、脱皮阶段）、发育阶段、食物供应程度等均影响生物对毒物的敏感性。

2、试验条件：如试验水质的温度和含盐量、水流速度和溶解氧、水域的酸碱度、受试生物的总量，不仅影响生物对毒物的反应，而且影响作用于生物的毒物浓度、性质和形态。3、实验操作：实验结果还受人员操作水平、仪器设备的精度、测定方法的影响。13本文档共99页；当前第13页；编辑于星期三\14点54分（二）标准化测试的优点1）增加数据的精确度，利于数据的比较。2）测试可以被其它实验室重复。3）筛选不同实验室一致的实验结果。4）可为环境标准的建立提供可靠的数据，如饮用水环境质量标准等。14本文档共99页；当前第14页；编辑于星期三\14点54分（三）标准化的生物测试方法有《水质物质对蚤类急性毒性测定方法《B/T13266-91)》、《水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法(GB/T13267-91)》等。

主要对1）毒物的分析方法、环境条件的测定方法，2）仪器设备,3）生物大小、生物量，4）水的溶解氧和pH,5）统计方法作出了国家规定。但对那些易分解、非常见和混合污染物的测定还很难进行标准化测定。15本文档共99页；当前第15页；编辑于星期三\14点54分

第二节生物毒性试验一、生物毒性（一）生物毒性的基本概念1、毒物（Toxicant）和毒性（1）毒物：在一定条件下，以较小剂量给予有机体时，与生物相互作用后而引起功能或器质性损伤的化学物质称毒物。或剂量虽微，但积累到一定量时，就能干扰或破坏机体的正常生理功能，而引起暂时或持久性病变，甚至危及生命的化合物，称毒物。16本文档共99页；当前第16页；编辑于星期三\14点54分

（2）毒性(Toxicity):指毒物产生有害作用的能力。与下列因素有关：1）进入机体的剂量。体内潜在性有毒物质存在并不意味发生中毒，通常只有达中毒剂量时，才可引起中毒。2）进入机体的方式（如经口、皮肤或呼吸）。3）接触时间及频率。时间越长、频率越高，越引起中毒。

17本文档共99页；当前第17页；编辑于星期三\14点54分

2、中毒（toxication）受到毒物作用，引起生物有机体功能和器质性损伤后，所出现的疾病状态称中毒。如有机磷中毒后出现的震颤、出汗、瞳孔缩小等。中毒是在各种毒物作用下，在局部或全身的综合表现。（1）毒效应或毒性作用化学物引起生物有机体的损伤的总称为毒性作用或毒效应。可用相关生理生化指标表示。如有机磷农药对胆碱酯酶活性的抑制；苯抑制造血功能而引起贫血。18本文档共99页；当前第18页；编辑于星期三\14点54分

（2）毒物反应（reaction）

指接触化学物质后，表现某种效应的个体在一个群体中所占的比例。（3）毒物危险性和危害性

1）毒物危险性指某一化学物质在正常生产、使用过程中，能引起有机体发生中毒的可能性，称毒物危险性，是毒物对个人或群体的毒性效应和产生疾病甚至死亡的定量估计。19本文档共99页；当前第19页；编辑于星期三\14点54分

2）毒物危害性：指有毒物质与有机体接触和使用过程中，有引起中毒的可能性，称毒物危害性，用来定性表示毒物对人群健康引起的有害作用。物质危害性的大小一般与物质进入体内的能力和数量有关，挥发性小，易溶于水或血液中，并能迅速达到中毒浓度的物质的危害性大。

20本文档共99页；当前第20页；编辑于星期三\14点54分（二）毒性参数1、常用毒性参数

（1）致死剂量或致死浓度(LD，lethaldoseorLC，lethalconcentration)①绝对致死剂量或浓度（LD100，AbsolutelethaldoseorLC100，Absolutelethalconcentration）指一群动物全部死亡的最低剂量或浓度。②半致死剂量或浓度（LD50，MedianlethaldoseorLC50，Medianlethalconcentration）指能引起一群动物死亡50%的最低剂量或浓度。21本文档共99页；当前第21页；编辑于星期三\14点54分③最小致死剂量或浓度（MLD，Minimumlethaldose，MLC，Minimumlethalconcentration）：能使一群动物仅个别死亡的最高剂量或浓度。(2)最大耐受剂量和最大无作用剂量①最大耐受剂量或浓度（MTD0，MaximumtolerancedoseorMTC0，Maximumtoleranceconcentration）能使一群动物虽然发生严重中毒，但全部存活无一死亡的最高剂量或浓度。22本文档共99页；当前第22页；编辑于星期三\14点54分

②最大无作用剂量（Maximumnoeffectdose）污染物对生物产生效应随污染物浓度或剂量的降低而减弱，当外来化学物剂量减到一定量时，生物学变化已达到0，不能观察到任何损害作用的最高剂量称最大无作用剂量。其是制订人体每日容许摄入量、最高容许浓度和评定污染物毒性作用的主要依据。23本文档共99页；当前第23页；编辑于星期三\14点54分③最小有作用剂量（Minimaleffectlevel）指能使有机体发生某种异常变化所需的最小剂量。其一般大于最大无作用剂量，因此又称中毒阈剂量。④半数效应浓度(EC50,Medianeffectconcentration)指能引起50%受试生物的某种效应变化的浓度。⑤半数抑制浓度(IC50,Medianinhibitionconcentration)指能引起受试生物的某种效应50%抑制的浓度。24本文档共99页；当前第24页；编辑于星期三\14点54分（3）毒作用带（Toxiceffectzone）：是恒量污染物危险性大小的一个指标。

①急性毒性作用带：为半致死量与急性毒性最小有作用剂量的比值。此值愈大，污染物危险性愈小，反之危险性愈大。25本文档共99页；当前第25页；编辑于星期三\14点54分

②慢性毒性作用带：是恒量毒物急、慢性毒性的一个指标，急性毒性最小有作用剂量与慢性毒性最小有作用剂量之比。比值愈小，表明引起急性中毒的危险性相对较大。反之，引起慢性毒性中毒的可能性愈大。26本文档共99页；当前第26页；编辑于星期三\14点54分2、毒物单位与分级

（1）毒物单位（浓度）：毒物在空气中的浓度以mg/m3或mg/L表示；哺乳动物以mg/Kg或ml/kg体重表示；水环境中的毒物以mg/L或μg/L表示。

（2）毒物分级：毒物毒性的大小与半数致死量成反比，但不同化合物之间毒性差别很大，可达百万甚至几千万倍。为了加强毒物在生产、运输、使用和贮存方面的管理；便于制订和比较环境质量标准；在发生意外时,采取相应的保护措施，必须对毒物进行分级。

27本文档共99页；当前第27页；编辑于星期三\14点54分1）我国工业毒物急性毒性分级

28本文档共99页；当前第28页；编辑于星期三\14点54分2）我国农药急性毒性分级

29本文档共99页；当前第29页；编辑于星期三\14点54分

3）水生生物评价体系

30本文档共99页；当前第30页；编辑于星期三\14点54分二、毒性试验（一）急性毒性试验指研究化学物质大剂量一次染毒或者说24h内多次染毒，动物所引起的毒性试验。目的：为了在短期内了解某物质的毒性大小，需做急性毒性试验(Acutetoxicitytest)。有哺乳动物急性毒性试验、水生生物急性毒性试验和蚯蚓急性毒性试验。31本文档共99页；当前第31页；编辑于星期三\14点54分1、哺乳动物急性毒性试验：（1）实验材料：小鼠和大鼠，若进行毒物皮试实验，还可用家兔和豚鼠。（2）确定动物全活和全致死量查阅文献中与受试物的类似物的LD50(LC50)，一般以3倍之差配制三个剂量组进行预试验（1/3LD50，LD50,3LD50），每组3只动物，求出全致死量和全活剂量。32本文档共99页；当前第32页；编辑于星期三\14点54分33本文档共99页；当前第33页；编辑于星期三\14点54分（3）在预试验的全活量和全致死量之间，以各组间距1.2~1.5的“等比级数”，计设5~6个剂量组，进行染毒。观察2周内的死亡情况。（4）病理解剖检查：剖检死亡或濒死动物及部分存活的动物，计算LD50或LC50。（5）依急性毒性分级标准，根据LD50或LC50，评定毒物的毒性，LD50值愈小，毒性愈大。34本文档共99页；当前第34页；编辑于星期三\14点54分2、水生生物急性毒性试验根据试验对象，可分为鱼类、水蚤类和藻类毒性试验。

（1）实验用鱼：选择有区域代表性、便于实验饲养、对物质敏感的鱼苗，如青、草、鲢及鳙四大淡水鱼。体长一般小于7cm为宜。有时还可用体长小于3cm的金鱼。（2）实验条件：采用玻璃缸或白搪瓷桶。盛水量以每条2~3L水为宜，pH6.7~8.5，冷水温度12~18℃，温水温度20~28℃，水温变化±2℃，水中溶解氧不能低于4mg/L，可用清洁河水、湖水或放置3天的自来水。35本文档共99页；当前第35页；编辑于星期三\14点54分36本文档共99页；当前第36页；编辑于星期三\14点54分（3）LC50测定1）确定鱼全活和全致死量：方法同哺乳动物，也从文献中查阅与受试物的类似物的LD50(LC50)，做预试验，确定全致死量和全活剂量。2）以此浓度范围，按“等对数间距”确定5~7个浓度组。每组10~20尾鱼，染毒48~96h。染毒刚开始8h内经常观察，以后作24、48、72和96小时定期观察，记录中毒反应和死亡时间。（实验期间注意保持水体溶解氧、pH、水温的稳定，并立即取出死鱼）。3）根据24、48和96h各组鱼的死亡数，计算LC50。37本文档共99页；当前第37页；编辑于星期三\14点54分（二）亚慢性毒性试验（Subchronictoxicitytest）人类接触的环境污染物水平通常低于急性中毒剂量或浓度，为了得到更接近实际情况的毒作用资料，需进行亚慢性和慢性毒性试验。在较长时期内（约动物生命周期的1/30~1/20），使动物每日或反复多次染毒所进行的实验。目的是为对毒物的毒作用机理、靶器官和最大无作用剂量或中毒阈值作出估计。

38本文档共99页；当前第38页；编辑于星期三\14点54分1、动物选择（1）一般选用对毒物敏感的动物种和品系，且应与慢性毒性作用试验中预计使用的动物相同。（2）要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种，啮齿动物常用鼠和兔，非啮齿常用狗和猫。这样可更全面了解受试物的毒草效应。39本文档共99页；当前第39页；编辑于星期三\14点54分（3）动物大小、只数和雌雄选用健康、年幼的动物。小鼠约14~17g，大鼠50~80g，家兔和猫体重约1~2kg，狗体重为5~8Kg。各动物体重不应超过组平均体重的±20%。大鼠各组不少于20只，兔、猫和狗较大动物不少于4~6只。雌雄各半。

40本文档共99页；当前第40页；编辑于星期三\14点54分2、染毒剂量和实验期限（1）染毒剂量:一般用LD50或LC50的1/80~1/50作为亚慢性试验剂量，也设三个剂量组。1）高剂量组：能引起明显的中毒反应，但又不引起很多动物死亡为高剂量组。2）低剂量组：不引起任何中毒反应为低剂量组。3）中间剂量组：介于二者之间。（2）实验期限:试验期限随目的和要求或动物大小而异。大鼠可90天，较大动物可4~6月。41本文档共99页；当前第41页；编辑于星期三\14点54分3、染毒途径

主要经胃肠道、呼吸道和皮肤接触。注意：染毒途径应与预期进行的慢性毒性作用试验相一致。4、指标观察与检查：3个（1）综合指标观察：1）观察动物的一般活动、症状和死亡情况。2）每周称重一次，记录饲料或饮水量，计算生长率（各组每周摄入食量与体重增加量之比）。3）各脏器鲜重与单位体重的比重（脏器系数）。42本文档共99页；当前第42页；编辑于星期三\14点54分（2）血液及生化检查：主要指血清、肝和肾功能检验。常规项目包括血红蛋白、红、白细胞数、血小板数、谷草转氨酶、血清尿素氮等。（3）病理组织学检查：尸检死亡和濒死的动物，以及实验结束后的被处死的动物。主要对肝、肾、睾丸等器官进行检查。必要时还需进行组织化学和电镜检查。43本文档共99页；当前第43页；编辑于星期三\14点54分5、试验评价对受试物的主要毒作用、靶器官和最大无作用剂量及中毒阈剂量作出初步估价，并为进一步开展慢性毒性试验提供依据。

44本文档共99页；当前第44页；编辑于星期三\14点54分（三）慢性毒性试验(哺乳动物)（Chronictoxicitytest）以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触，观察其对试验动物所产生的生物学效应的试验。目的是确定最大无作用剂量，为制订人体每日允许摄入量(ADI，Allowabledailyintake)和最高容许浓度(MAC，Maximumallowableconcentration)提供毒理学依据。有哺乳动物、水生生物慢性毒性试验。

45本文档共99页；当前第45页；编辑于星期三\14点54分1、试验动物和分组1）试验动物的年龄应低于亚慢性试验。一般选用断奶动物，如出生后3周的小鼠，体重约10~12g，出生后3~4周的大鼠，体重50~70g。2）试验动物雌雄各半。其它与亚慢性试验相同。46本文档共99页；当前第46页；编辑于星期三\14点54分2、染毒剂量和实验期限根据亚慢性试验，取其最低中毒剂量的1/10、1/20和1/50或LD50的1/100~1/20中取3~4个剂量作为慢性试验剂量。（1）高剂量组：能引起明显的中毒反应为高剂量组。（2）低剂量组：不引起中毒反应为低剂量组。（3）中间剂量组：介于二者之间。试验期限：一般1~12月，若是致癌实验则需18~24月。47本文档共99页；当前第47页；编辑于星期三\14点54分3、染毒途径

经胃肠道、呼吸道和皮肤接触同亚慢性试验4、观察指标基本同亚慢性试验，此外：（1）在试验的第1个月，每周称体重一次，在4~6个月期间，每2周称体重一次，以后每4周称体重一次。（2）每2月进行一次血液及其它生长指标(生长率、脏器系数)测定。（3）对病理检查作半定量评定，即随染毒时间的延长，器官形态结构会发生变化，需根据病变程度加以分级评分。

48本文档共99页；当前第48页；编辑于星期三\14点54分49本文档共99页；当前第49页；编辑于星期三\14点54分5、试验评价:评价受试物在低剂量长时间接触有机体时所引起的毒性作用。有2个方面：1）依据敏感观察指标，出现异常的最小阈剂量，找出该受试物的慢性毒作用的最大无作用剂量，为受试物能否可被应用或为制订其在环境中的卫生标准，提供依据。2）通过对动物的一般观察及其对各脏器的病理学检查，对受试物的致癌性评定提供依据。50本文档共99页；当前第50页；编辑于星期三\14点54分（四）蓄积毒性试验1、低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次地与机体持续接触，经一定时间后使机体出现明显的中毒表现，即为蓄积毒性作用(Cumulativetoxicityaction)。

（1）物质蓄积：环境污染物不断进入有机体，若吸收量大于排出量，使其在体内的量逐渐积累增多。

（2）功能蓄积：不断进入有机体的污染物反复作用于机体，引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最后导致出现损害作用。51本文档共99页；当前第51页；编辑于星期三\14点54分2、试验方法（1）蓄积系数法（CumulativeCoefficientmethod）

蓄积系数（CumulativeCoefficient）：指多次给受试物后，引起50%受试动物出现某种毒效应的总剂量()，与一次给受试物后引起50%受试动物出现同一毒效应的剂量（）的比值。比值愈大，说明引起50%动物出现某种毒效应的使用剂量较大，药物代谢作用强，而蓄积作用较小，反之，表示蓄积作用愈强。52本文档共99页；当前第52页；编辑于星期三\14点54分

53本文档共99页；当前第53页；编辑于星期三\14点54分有两种实验方法测定K1）固定剂量每天连续染毒法对受试动物以1/10~1/20LD50的固定剂量，每天进行染毒一次，观察记录动物死亡情况。当染毒累计达5个LD50以上时，若受试动物死亡数未超过半数，此时的蓄积系数已大于5，表明该受试动物的蓄积作用不明显。

54本文档共99页；当前第54页；编辑于星期三\14点54分2）剂量定期递增染毒法取一组受试动物，每天染毒一次，以4天为一期，开始的第一期每天染毒剂量为1/10LD50,随后染毒剂量每隔4天按1.5倍递增一次。

55本文档共99页；当前第55页；编辑于星期三\14点54分每天记录动物的死亡情况，若连续染毒已达20天，此时,每天的染毒剂量0.5LD50(=1.54×LD50/10)，累计总剂量达[(1+1.5+1.52+1.53+1.54)×4×LD50/10]=5.30LD50。如果受试动物死亡未达到50%,则表示该受试物的蓄积作用不明显，试验可停止。如果受试动物出现死亡达50%，就可算出染毒系数K。56本文档共99页；当前第56页；编辑于星期三\14点54分（2）20天蓄积试验法按的LD50的1/20、1/10、1/5、1/2和0随机分成5组，每天对动物进行染毒，连续20天，各组总剂量分别为0、1、2、4、10LD50。观察停药7天内的死亡情况。1）如1/2LD50组有死亡，且各剂量组呈剂量-反应关系，则受试动物有较强的蓄积作用。2）若1/20LD50组有死亡，且各剂量组呈剂量-反应关系，则为中等蓄积作用。3）若1/20LD50组无死亡，且各剂量组无剂量-反应关系，则为无明显蓄积作用。

57本文档共99页；当前第57页；编辑于星期三\14点54分（3）受试物生物半减期测定法

生物半减期（T1/2）：指一种外来化合物在体内的量或浓度下降到原来浓度或量的一半所需的时间。T1/2越大，表明在体内存留时间越长，蓄积作用越大。测定方法：机体接触污染物后，在间隔一定时间内分别测定血液、尿液、器官组织中该物质的浓度，然后求出T½。

（y1和y2分别是t1和t2时间测得该物质的浓度）58本文档共99页；当前第58页；编辑于星期三\14点54分

第三节生物致突变、致畸和致癌效应检测一、生物致突变1、突变：生物体的遗传物质发生了基因结构的改变称为突变（mutation）。可分为基因突变和染色体突变两大类，此两类突变本质上无差异，只是染色体突变可凭光学显微镜观察。

59本文档共99页；当前第59页；编辑于星期三\14点54分2、突变意义（1）农业作物育种：在农业生产中，农作物就是通过定向突变筛选获得优良品种。（2）从理论上讲，突变可能会出现有益的后果，但由于概率极小，且无法鉴别和控制，所以，外来化学物对人类引起的致突变可能有很大的潜在危险。所以，从毒理学角度，突变一般认为是外来化合物毒性作用的表现。60本文档共99页；当前第60页；编辑于星期三\14点54分3、致突变试验试验方法致突变试验：可分基因点突变试验、染色体畸变试验和DNA损伤试验等，可在活体或体外进行。有（1）体外基因突变试验，（2）细胞遗传学实验，（3）体内基因突变试验，（4）DNA损伤试验等。

61本文档共99页；当前第61页；编辑于星期三\14点54分（一）体外基因突变试验（Invitromutationtest）

1、鼠伤寒沙门氏菌试验法（1）基本原理

将一种营养缺陷型如不能合成组氨酸的鼠伤寒沙门氏菌和化学致突变物接触，若此化合物是致突变性的，则可使此突变微生物发生回复突变，重新成为野生型，而能在不含或少含His的培养基中生长。据此鉴定化合物的致突变作用。为使受试物在体外测试中获得同活体类似的代谢活性，在培养基中常加入哺乳动物肝细胞的微粒体和受氢系统。62本文档共99页；当前第62页；编辑于星期三\14点54分（2）方法优缺点优点：方法简单；快速，一般在48h内可得出结论；费用低；灵敏，检测结果与动物致癌性相符率达90%。缺点：1）微生物的遗传信息含量低，仅为哺乳动物的1/6。2）微生物DNA修复系统没有哺乳动物复杂而精巧。3）微生物无免疫功能。4）对于不在肝脏代谢转化的化合物，如苏铁素，不能检测其突变性。63本文档共99页；当前第63页；编辑于星期三\14点54分2、哺乳动物体细胞株突变试验基本原理：有些哺乳动物突变细胞株系，当与化学致突变物接触后会发生回复突变，代谢发生改变，依此确定毒物的致突变性。常用细胞突变系：中国地鼠肺细胞V79、中国地鼠卵巢细胞株CHO和小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株等。64本文档共99页；当前第64页；编辑于星期三\14点54分（1）肺细胞V79和卵巢细胞株CHO细胞突变株系由于嘌呤碱类似物如6-巯基嘌呤可抑制DNA的合成，正常细胞株系生长会受到抑制。而V79和CHO细胞突变株系由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)，当在培养基中加入某些嘌呤碱类似物如6-巯基嘌呤等时，它们仍能生长。当V79和CHO细胞突变系与这些嘌呤碱类似物接触后，会发生回复突变成正常株，生长受到抑制，说明发生了致突变。

65本文档共99页；当前第65页；编辑于星期三\14点54分

（2）小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株

此细胞株系缺乏胸苷激酶(TK),如在培养基中加入细胞毒素5-溴脱氧尿苷，仍能生长。但当此种细胞系与致突变物接触后会发生回复突变，又转化为正常细胞，而恢复对此毒素的利用，而抑制其生长。说明发生了致突变。66本文档共99页；当前第66页；编辑于星期三\14点54分（二）细胞遗传学实验(CytogeneticsTest)1、染色体畸变试验(Chromosomeaberrationtest)利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受致突变物作用后,染色体数目和结构的变化。

(1)离体试验：常用中国地鼠卵巢细胞株CHO（缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)和人类外周血（指进入血液循环的血液，即平时所采血），检测卵巢细胞株CHO和人类淋巴细胞的染色体变化。

(2)体内试验：常检查骨髓细胞、胸腺、脾、精原细胞的染色体的畸变。

67本文档共99页；当前第67页；编辑于星期三\14点54分CHO细胞系或人类淋巴细胞染色体畸变分析1）选用细胞培养液如DMEM、RPM或1640任一种，加入化学致突变物，在3℃下，培养CHO（缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)细胞24h或人类淋巴细胞为72h。2）在收获细胞前2h，向培养液中加入秋水仙碱，以终止细胞分裂，使细胞分裂同步于分裂中期。3）离心得到沉淀细胞，然后制片镜检有无染色体畸变。4）观察染色体有无断裂、缺失、易位、形成环状结构等畸变，以及出现多处断裂的百分率。68本文档共99页；当前第68页；编辑于星期三\14点54分69本文档共99页；当前第69页；编辑于星期三\14点54分染色体畸变结果评定

确定受试物能否引起染色体损伤或数目的改变，以及要确定有这些改变的细胞能否存活一个细胞周期以上。1）一些小缺失和相互易位的畸变，因其可能长期存在而比大缺失有更大的危险性。2）染色体断裂、缺失、易位、形成环状结构等是染色体开放性断裂的结果，但也可能是断裂后修复的结果。3）有些化合物只作用于细胞分裂某一时期，故试验时要注意收获时间。

70本文档共99页；当前第70页；编辑于星期三\14点54分2、微核试验（Micronucleustest）（1）微核形成

核膜受损：在受化学致突变作用下，若核膜受损，核物质会向外突出延伸，形成一个或几个规则圆形或椭圆形小体，称微核。

纺锤体受伤：由于纺锤体受伤或染色体的无着丝点断裂，受伤染色体在分裂后期仍停留在细胞质，而形成微核结构。有动物细胞微核率试验、细胞培养微核试验和蚕豆根尖微核试验等。71本文档共99页；当前第71页；编辑于星期三\14点54分72本文档共99页；当前第72页；编辑于星期三\14点54分

（2）动物细胞微核率试验

1）骨髓嗜多染红细胞微核试验以颈椎脱臼处死动物，用小牛血清将骨髓细胞冲洗入离心管。离心，弃去上清液，留少量血清悬浮细胞后进行涂片。甲醇固定、Giemsa染色（核染色）后进行观察。每只动物要求观察计数1000个嗜多染红细胞，求出出现微核细胞的频率。73本文档共99页；当前第73页；编辑于星期三\14点54分2）外周血淋巴细胞微核试验取人或动物的外周血2~3滴(骨髓外血），于盛有1.5mlTris-NH4Cl缓冲液的离心管中，混匀后置于37℃下保温5h，使红细胞溶解。取5滴溶解液，混匀后离心，弃上清液，于沉淀物中再加5ml固定液，放置10min后离心，弃上清液，取沉淀物涂片，镜检。

74本文档共99页；当前第74页；编辑于星期三\14点54分二、致畸效应（一）基本概念1、致畸作用（Teratogenesis）

胚胎的细胞分化和器官形成不正常，而造成组织器官上的缺陷，并出现肉眼可见的形态结构异常称畸形。致畸物通过母体作用于胚胎，引起胎儿畸形的现象称致畸作用。目前已知1000多种环境因素可引起动物及人的畸胎。60年代初，孕妇因服用“反应停”而导致近万名畸形儿。许多国家对一些药物、农药、食品添加剂、防腐剂以及工业化学品规定应经过致畸试验。

75本文档共99页；当前第75页；编辑于星期三\14点54分76本文档共99页；当前第76页；编辑于星期三\14点54分2、致畸作用的毒理学特点(1)不同发育阶段的胚胎对致畸物有不同的敏感性，一般在胚胎形成早期，对致畸物最敏感。致畸物在接触胚胎时，可因胚胎处于不同发育阶段而引起不同的畸形。(2)不同种系的动物，由于代谢和胎盘结构的不同，对致畸物呈现不同的敏感性。（3）致畸作用剂量-反应曲线很陡，最大无作用剂量与引起胚胎死亡最低剂量仅相差2~3倍。

77本文档共99页；当前第77页；编辑于星期三\14点54分3、化学致畸作用机理(1)母体正常代谢过程受到破坏致畸物使母体正常代谢过程受到破坏，使子代细胞在生物合成过程中缺乏必需的物质，而影响胚胎的正常发育。(2)生殖细胞分裂过程的障碍致畸物可干扰细胞的分裂过程,引起生殖细胞减数分裂或合子的细胞有丝分裂过程的障碍,导致细胞死亡,胚胎出现畸形。

78本文档共99页；当前第78页；编辑于星期三\14点54分(3)突变引起胚胎体细胞发育异常致畸物可使胚胎的体细胞发生突变,有时还可引起酶分子的氨基酸组成发生改变,而引起代谢功能的缺陷,胚胎致畸。(4)通过抑制或破坏重要代谢酶的活性起作用这些致畸物虽不影响生殖细胞减数分裂或细胞有丝分裂或诱发染色体突变，但可通过抑制或破坏对细胞生长分化较为重要的酶的活性,如DNA聚合酶、核糖核苷酸还原酶等活性，而影响胚胎的正常发育。79本文档共99页；当前第79页；编辑于星期三\14点54分（二）试验方法致畸试验：是检测某些环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形的一种动物试验法。1、动物选择要求：(1)选择与人类代谢相似的动物，并具与人类相似的胎盘结构，如胎盘层数和厚度。(2)妊娠期短,利于观察。(3)产仔多,以获得足够的标本。(4)此外,还应符合试验动物的一般要求,如体型小、易驯服、繁殖以及价廉。一般选择大鼠和小鼠和家兔。80本文档共99页；当前第80页；编辑于星期三\14点54分2、剂量设定(1)受试物剂量的大小，应根据试验时给予受试物的次数及连续时间的长短而定，若试验期间只给一次，此时剂量稍大，反之则小。（2）高剂量组，以不使母体产生明显中毒而导致流产为限度。一般可以LD50的1/3~1/2为最高剂量组，LD50的1/30~1/100为低剂量组。（3）试验动物数：均以经交配确定已受精的雌性动物为计数对象，每组不少于15~20只，家兔7~8只。81本文档共99页；当前第81页；编辑于星期三\14点54分3、受试动物的处理（1）动物受孕：选择一批性成熟，未交配过的雌鼠和雄鼠，以一雄一雌或二雌一雄比例，同笼过夜，次日清晨检查雌鼠是否受孕。查到日为孕期0天，次日为第一天，孕期约1月。（2）药物处理方法和时间：一般多采用灌胃方法，在胚胎敏感期给药。若过早给予可影响受精卵着床，过迟则对发育成熟的胚胎往往不能显示致畸作用。82本文档共99页；当前第82页；编辑于星期三\14点54分4、试验动物的解剖（1）解剖时间：预计自然分娩前1~2天为宜，以防止胎仔自然分娩后被吃或被咬伤。可留1/4的动物待其自然分娩，并将胎仔喂养到断奶，进行仔细观察和检查。（2）解剖检查1）胎仔外部检查：如活胎数、早、晚期死胎数和吸收胎数；对活胎要检查性别、体重、身长、尾长及全窝胎盘总重量等。83本文档共99页；当前第83页；编辑于星期三\14点54分2）胎仔的骨骼检查先用75%~90%乙醇-1%KOH固定至肌肉透明;再用茜素红染色2~5d，至骨骼染成桃或紫红色;再经透明处理后，检查骨骼的形态、大小、数量有无异常及骨化程度。

3）胎仔内脏检查经外观检查后的活胎仔，按随机法，将胎仔数的1/2~1/3置于Bouin氏液中固定1~2周后，取内脏和软组织如腭裂、肾等，用徒手切片法制片，观察结构变化。P126，表3-11（外观畸形）；表3-12（骨骼畸形）；表3-13（脏器畸形）。84本文档共99页；当前第84页；编辑于星期三\14点54分5、致畸作用的评价为科学的评价受试物有无致畸作用。应注意：(1)试验结果中出现的畸形率高低,须从出现畸胎的孕仔率、胎仔发生畸形率、单项畸形率、总畸形率等多方面进行统计综合分析；比较试验组与对照组有无差异；有无剂量-反应关系；而后才能作用评定。(2)同种动物重复试验和多种动物试验的结果一致,才能得出一致的结论。

85本文档共99页；当前第85页；编辑于星期三\14点54分(3)生物在正常情况下也有变异，有时难以区分。但一般致畸率高、有特异性、且有剂量-效应或反应关系，应作致畸论。(4)不同种系的动物对同种致畸物的致畸作用可能有差异。当在其它动物上试验的结果，和从临床观察、流行病学调查等如果也获得同样的结果，才能下正确的结论。

86本文档共99页；当前第86页；编辑于星期三\14点54分三、致癌效应（一）基本概念目前的中国癌症诊断率6人/min，其中有1人得肺癌。据估计人类肿瘤有80%~90%与环境因素有关，其中化学因素有关者占80%~85%，因此，化学致癌作用极其重要。化学物质（有机、无机、合成）引起肿瘤的过程称化学致癌作用。能诱发肿瘤的化学物质称化学致癌物。87本文档共99页；当前第87页；编辑于星期三\14点54分癌细胞的主要特征1、丧失细胞接触性生长抑制特性，恶性增长不死细胞。2、形态显著改变的变态细胞。3、细胞膜上的糖蛋白减少，易在体内分散和转移。为粘着性降低的扩散细胞。