内质网应激在T细胞活化诱导凋亡中的作用

内质网应激在T细胞活化诱导凋亡中的作用严成;金慧敏;颜楠楠浒洁消腾飞;周丽萍;邵启祥;夏圣【摘要】目的:探讨内质网应激在T细胞活化诱导细胞凋亡(activation-inducedcelldeath,AICD)中的作用.方法:建立小鼠T淋巴瘤EL-4细胞和成年C57BL/6小鼠T细胞AICD的模型，流式细胞术测定发生AICD的细胞凋亡率;流式细胞术测定不同浓度CD3抗体对EL-4细胞AICD发生的影响;将小鼠AICD模型T细胞分为对照组、模型组、激动组(加入内质网应激激动剂二硫苏糖醇)、抑制组(加入内质网应激抑制剂4-苯基丁酸)，流式细胞术测定各组细胞凋亡率结果:EL-4细胞和C57BL/6小鼠T细胞发生AICD时细胞凋亡率升高;随着CD3抗体浓度增加,EL-4细胞发生AICD的比例增加;激动组小鼠T细胞发生AICD的比例增加,抑制组小鼠T细胞发生AICD的比例降低抑制剂组细胞凋亡水平较对照组降低结论:增强内质网应激可促进T细胞发生AICD,抑制内质网应激可减少T细胞发生AICD.%Objective:Toexploretheroleofendoplasmicreticulum(ER)stressinactivation-inducedcelldeath(AICD)ofTcells.Methods:ThemodelofAICDwassetupbyusingEL-4cells(miceTlymphomacell)andtheTcellofadultC57BL/6mice,thecellapoptosisofAICDwasmeasuredbyflowcytometry.TheeffectofCD3antibodyconcentrationsonEL-4cellAICDwasassessedbyflowcytometry.FlowcytometrywasusedtoobserveandanalyzetheapoptoticcellsofagonistgroupwhichaddedwithERstressinducerdithiothreitolandinhibitiongroupwhichaddedwithERstressinhibitor4-phenylbutyricacidinTcellAICDofadultC57BL/6mice.Results:ThecellapoptosiswasincreasedwhenAICDformedinEL-4cellandTcellinC57BL/6mice.WiththeincreaseofCD3antibodyconcentration,theoccurrencerateofEL-4cellAICDincreased.DithiothreitolinducedtheoccurrenceofTcellAICDinmice,while4-phenylbutyricacidreducedtheoccurrenceofTcellAICDinmice.Conclusion:TheinductionofERstresscouldpromoteTcellAICD,whileinhibitionofERstressdecreaseTcellAICD.【期刊名称】《江苏大学学报(医学版)》【年(卷)，期】2017(027)003【总页数】4页(P205-208)【关键词】内质网应激;T细胞;活化诱导细胞凋亡【作者】严成;金慧敏;颜楠楠浒洁消腾飞;周丽萍;邵启祥;夏圣【作者单位】江苏大学医学院免疫学与免疫检验教研室,江苏镇江212013;江苏大学医学院医学检验研究所,江苏镇江212013;江苏大学医学院免疫学与免疫检验教研室，江苏镇江212013;江苏大学医学院医学检验研究所，江苏镇江212013;江苏大学医学院免疫学与免疫检验教研室,江苏镇江212013;江苏大学医学院医学检验研究所，江苏镇江212013;江苏大学医学院免疫学与免疫检验教研室,江苏镇江212013;江苏大学医学院医学检验研究所，江苏镇江212013;江苏大学医学院免疫学与免疫检验教研室,江苏镇江212013;江苏大学医学院医学检验研究所，江苏镇江212013;江苏大学医学院分子生物学及检验教研室，江苏镇江212013;江苏大学医学院免疫学与免疫检验教研室,江苏镇江212013;江苏大学医学院医学检验研究所，江苏镇江212013;江苏大学医学院免疫学与免疫检验教研室,江苏镇江212013;江苏大学医学院医学检验研究所，江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】R392.12内质网在新合成的跨膜蛋白和分泌蛋白的合成、折叠、修饰和转运过程中起着重要的作用［1］。未折叠蛋白和错误折叠的蛋白在内质网中聚积可导致内质网应激，进而引发一系列严重疾病，例如al-抗胰蛋白酶缺乏症、1型糖尿病、克雅氏病和囊性纤维化［2-4］。内质网应激会触发一个适应性反应，称为未折叠蛋白反应，由三个内质网穿膜蛋白调控，即抑制物阻抗性酯酶1、RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶和激活作用转录因子［5］。通过提高与内质网蛋白折叠相关酶类和分子伴侣的水平，增强错误蛋白的降解能力和减少蛋白的翻译，可使内质网回到稳态［6］。T细胞受到抗原刺激时，大量增殖，活化成效应T细胞，清除抗原，维持免疫稳态。当抗原清除后，机体可启动活化诱导细胞凋亡(activationinducedcelldeath,AICD)途径，调控活化的T细胞凋亡，以免发生自身免疫性疾病。以往研究表明，内质网应激是细胞发生凋亡的途径之一［7］，但内质网应激在T细胞AICD中的作用尚不清楚。本研究在建立AICD模型的基础上，结合流式细胞术分析，并应用内质网应激激动剂二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸，探讨内质网应激对T细胞AICD的影响，以期进一步了解内质网应激在特异性细胞免疫中的调控机制。1.1研究对象小鼠T淋巴瘤EL-4细胞为本实验室传代保存；6~12周龄的雄性C57BL/6小鼠购自扬州大学比较医学中心，本实验室繁育后用于实验。1.2主要试剂和仪器RPMI1640培养基、胎牛血清（PAA公司），6孑L、24孑L、96孑L板（Nunc公司），4-苯基丁酸、DTT、刀豆蛋白A（Con-A,Sigma-Aldrich公司），重组小鼠IL-2蛋白、功能性大鼠来源的抗小鼠CD3抗体（eBioscience公司），Annexin-V-FITC、7-AAD、CD4-PE（eBioscience公司）；超净工作台（苏州净化厂），细胞培养箱（Forma公司），倒置式生物显微镜（Nikon公司），台式离心机（Thermo公司），FACSCalibur流式细胞仪（BD公司）。1.3EL-4细胞和小鼠脾细胞体外诱导AICD将C57BL/6小鼠处死后，取脾脏，制备成单细胞悬液，以2x105细胞密度加入到96孔板，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37°C、5%CO2条件下培养。先用Con-A（5mg/L）刺激活化48h，再加入IL-2（10pg/L）培养48h，收集细胞，以2.5x105细胞密度转移至已用CD3（1mg/L）包被的96孔板，培养24h,体外诱导AICD。将荧光素标记的Annexin-V-FITC、7-AAD和CD4-PE分别加入细胞液。标记完成后，用PBS洗细胞2遍，流式细胞分析仪检测标记细胞的荧光信号，Flowjo软件分析数据。EL-4细胞的AICD诱导采用相同方法。1.4不同浓度CD3抗体对EL-4细胞AICD的影响经过Con-A和IL-2活化的EL-4细胞转移到CD3抗体包被的96孔板培养时，将CD3抗体的包被浓度分为0、1、5、10mg/L，培养24h。收集细胞，采用“1.3”中所述的AICD流式检测法进行荧光标记抗体等标记后，流式细胞仪检测标记细胞的荧光信号，Flowjo软件分析数据。1.5小鼠T细胞AICD的分组及处理将小鼠T细胞分为4组，对照组未行AICD诱导，模型组行AICD诱导，抑制组在诱导的基础上加入内质网应激抑制剂4-苯基丁酸，激动组在诱导的基础上加入内质网应激激动剂DTT。经Con-A和IL-2活化的脾细胞转移至CD3抗体包被的96孔板培养，同时激动组、抑制组中分别加入DTT或4-苯基丁酸（终浓度1mmol/L），继续培养24h。收集细胞，采用“1.3”所述的AICD流式检测法进行荧光标记抗体等标记后，流式细胞仪检测标记细胞的荧光信号，Flowjo软件分析数据。2.1EL-4细胞AICD体外诱导模型的鉴定如图1所示，与对照组相比，模型组小鼠T淋巴瘤EL-4细胞株凋亡率明显增高，达28.5%，说明用Con-A结合IL-2和CD3抗体可成功诱导EL-4细胞发生AICD。EL-4细胞活化后，大量细胞聚集成团；经诱导凋亡后，细胞体积缩小，胞膜结构仍然完整。2.2小鼠CD4+T细胞AICD体外诱导模型的鉴定如图2所示，小鼠脾细胞中CD4+T细胞经诱导、活化后发生AICD;与对照组相比，模型组细胞凋亡率明显增高，达71.16%。2.3不同浓度CD3抗体对T细胞AICD发生的影响结果显示（图3）,CD3浓度为1mg/L时，可诱导EL-4细胞发生AICD。当CD3浓度增至5mg/L时，EL-4细胞发生AICD的比例增加，但幅度不大；而CD3浓度增至10mg/L,EL-4细胞发生AICD的比例较1mg/L明显增加，由27.7%增加至39.4%。2.4内质网应激对T细胞AICD的影响结果显示（图4）,内质网应激激活可致CD4+T细胞凋亡率明显升高。与对照组相比，激动组存活的CD4+T细胞群体明显降低。相反，抑制组CD4+T细胞凋亡率（68.46%）明显低于激动组（89.70%）和模型组（79.19%）。AICD对免疫稳态的维持必不可少。多项研究表明，在免疫系统中，机体可通过发生AICD来调控活化的T细胞存活或凋亡，以防止释放有害细胞因子的活化T细胞过度聚积，从而调节自身的细胞免疫反应。如若AICD不能顺利进行，将会导致机体发生系统性自身免疫性和淋巴细胞积累的淋巴增殖性疾病［8-9］。本文应用Con-A结合IL-2和CD3抗体的方法，成功诱导T细胞发生AICD，且随着CD3抗体浓度的增加，T细胞发生AICD的比例也增加，说明更强的细胞受体强度交联支持细胞死亡超过细胞的激活，而较弱的初始细胞刺激没有触发细胞死亡导致T细胞活化。在细胞死亡、分化和环境刺激的过程中，内质网承担着不同程度的蛋白折叠负荷［10］。研究表明，不管在体内或体外，4-苯基丁酸可减弱内质网应激，阻断神经性疼痛、保护大脑，以免发生脑缺血性损伤和防止心脏纤维化［11-12］。而DTT可以诱导细胞蛋白错误折叠，从而发生内质网应激［13］。本实验结果表明，内质网应激诱导剂DTT可增强CD4+T细胞凋亡，而内质网应激抑制剂4-苯基丁酸则明显抑制CD4+T细胞凋亡，说明抑制内质网应激后，T细胞的AICD过程受到抑制。由此说明，在T细胞发生AICD时，内质网应激起重要作用。有研究表明，内质网应激也与辅助性T细胞的分化有关［14-15］。而抗肿瘤T细胞过早发生AICD会导致以T细胞为主的免疫监视功能受限［16］。因此，内质网应激可以是—个免疫调节靶点，可通过调控T细胞内质网应激的激活，进而调控T细胞的生物学功能，从而实现对T细胞介导的细胞免疫功能的调节。细胞凋亡过程涉及多种凋亡配体：凋亡相关因子配体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、肿瘤坏死因子相关弱凋亡的诱导物及其相关受体［17-18］。本实验室最近利用定向敲除内质网重要分子Sel1L小鼠T细胞进行的AICD诱导实验结果显示，在定向敲除Sel1L小鼠T细胞中，AICD的发生率明显降低，说明内质网内蛋白折叠及未折叠蛋白反应可影响T细胞功能（未发表）。但是内质网应激具体通过自身哪种途径影响T细胞的凋亡，以及影响哪种凋亡相关配体和受体等详细机制尚不清楚，还需行后续实验研究。［1］BegumG,HarveyL,DixonCE,etal.ERstressandeff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