生物大分子的分离纯化技术

生物大分子的分离纯化技术演示文稿本文档共33页；当前第1页；编辑于星期二\3点15分生物大分子的分离纯化技术本文档共33页；当前第2页；编辑于星期二\3点15分透析基本原理透析膜:

材料:火棉胶(Collodion),玻璃纸(Cellophane),纤维素(Cellulose)

纤维透析管的处理:1%乙酸水溶液1h,碱性EDTA(1%Na2CO3,1mMEDTA)煮1h,纯水清洗,保存.透析液:

水,缓冲液,高分子的浓溶液Donnan效应:pH变化

(勤换透析液,使用大量的透析液)本文档共33页；当前第3页；编辑于星期二\3点15分Donnan效应:本文档共33页；当前第4页；编辑于星期二\3点15分微过滤的类型:深层滤器(DepthFilter):滤膜滤器(ScreenFilter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)微过滤技术的应用:溶液的澄清微量沉淀物的收集细菌细胞的收集微过滤本文档共33页；当前第5页；编辑于星期二\3点15分盐析基本原理：

在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不断降低而沉淀析出，即盐析。盐析实验应注意的问题：

盐类的选择：硫酸铵（767g/l,25℃)

盐的饱和度：温度：室温或4℃pH：等电点蛋白质的浓度：本文档共33页；当前第6页；编辑于星期二\3点15分冷冻干燥基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下进行干燥的方法。冷冻干燥的条件：温度，-10~-40℃；真空度，13~40Pa。本文档共33页；当前第7页；编辑于星期二\3点15分离心基本原理种类：普通离心机（6000rpm)，高速离心机(25000rpm)，超速离心机转子：固定角度式，悬挂吊桶式本文档共33页；当前第8页；编辑于星期二\3点15分离心(2)离心力和相对离心力(Relativecentrifugalforce)：

F=mω2r;Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r沉淀速度与沉降系数：

F摩擦=fvF净=(Mp-Ms)ω2r-fv沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度），蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的范围.

以1×10-13s为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.

本文档共33页；当前第9页；编辑于星期二\3点15分离心(3)离心技术的类型：

最大速度方法：

移动界面（MovingBoundary)超速离心法移动区带(MovingZone)超速离心法

等密度方法(Iso-density)：本文档共33页；当前第10页；编辑于星期二\3点15分临床及生化分析样品的预处理

样品的类型、采集与保存酶样品的准备本文档共33页；当前第11页；编辑于星期二\3点15分样品的类型、采集与保存样品的类型：本文档共33页；当前第12页；编辑于星期二\3点15分样品的类型、采集与保存样品的采集血样：

全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml)

血浆：2000g离心10min

血细胞：血清：5~30min自凝分离

尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH<2.5)，碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）

唾液：

组织样品：液氮等冷冻本文档共33页；当前第13页；编辑于星期二\3点15分酶样品的准备酶活性的保持控制纯化过程中的pH、温度及有机试剂加入载体蛋白防止酶的吸附，如:BSA

加入辅助因子保护活性部位,如:EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽抑制蛋白酶的水解作用，如:氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）酰-亮-亮-精三肽等亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等样品制备从组织或器官制备样品从组织或器官培养液中制备样品从生物体液中制备样品（5000rpm,15min)

从细胞培养液制备样品本文档共33页；当前第14页；编辑于星期二\3点15分电泳分离纯化技术聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳高效毛细管电泳本文档共33页；当前第15页；编辑于星期二\3点15分电泳分离纯化技术基本原理

V=μeE(μe为电泳迁移率,即电场强度为1V/cm时的迁移速率.)影响电泳分离的因素:

物质本身的结构和性质:

荷电性质,形状

支持介质:吸附作用,电渗作用溶液介质:pH,离子强度电场强度:

常压

500V本文档共33页；当前第16页；编辑于星期二\3点15分聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶的结构和性质

凝胶的机械强度、弹性、透明度和黏度等取决于凝胶的总浓度:本文档共33页；当前第17页；编辑于星期二\3点15分聚丙烯酰胺凝胶电泳(2)凝胶电泳的装置柱型(ColumnGel):10cm×6cm

板型(SlabGel):12cm×12cm或14cm×16cm;

玻璃板间距1.75或1.5cm.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(盘状电泳)

电荷效应浓缩效应分子筛效应本文档共33页；当前第18页；编辑于星期二\3点15分不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳本文档共33页；当前第19页；编辑于星期二\3点15分聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量

1%SDS+0.1M巯基乙醇分子量1.0×104~2.0×105蛋白质的等电聚焦(IsoelectricFocusing,IEF)

原理

pH梯度的形成与保持

本文档共33页；当前第20页；编辑于星期二\3点15分琼脂糖凝胶电泳特点：适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好

胶浓度：0.5%~3%；分离1~9.0×107DNA片段

0.5~1.0%胶分离0.5~30kbDNA,

1.0~1.5%胶分离小片段本文档共33页；当前第21页；编辑于星期二\3点15分琼脂糖凝胶电泳的应用限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析DNA超螺旋结构的鉴定DNA分子量的测定脉冲场凝胶电泳本文档共33页；当前第22页；编辑于星期二\3点15分DNA分子量的测定本文档共33页；当前第23页；编辑于星期二\3点15分高效毛细管电泳仪器本文档共33页；当前第24页；编辑于星期二\3点15分毛细管:I.D,25~100μm;O.D.,100~400μm;L,0.1~1m进样系统:nL~pL,流体力学方法和电动进样高压直流电源：30kV,1~300μA

检测

紫外-可见吸收法荧光检测法电化学检测法质谱法本文档共33页；当前第25页；编辑于星期二\3点15分高效毛细管电泳基本概念：电泳淌度电渗流分析参数：淌度和迁移时间分离效率分离度本文档共33页；当前第26页；编辑于星期二\3点15分高效毛细管电泳分离模式毛细管区带电泳（CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)毛细管胶束电泳（CapillaryMicellarElectrokineticChromatography,CEKC)毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis,CGE)毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing,CIEF)本文档共33页；当前第27页；编辑于星期二\3点15分CGE的应用DNA序列分析蛋白质分析物理胶CZE本文档共33页；当前第28页；编辑于星期二\3点15分本文档共33页；当前第29页；编辑于星期二\3点15分本文档共33页；当前第30页；编辑于星期二\3点15分生物大分子的色谱分离纯化技术排阻色谱亲和色谱离子交换色谱反相及