Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响

Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响【摘要】在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响，证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用。实验结果表明在36h分别添加/L的上述三种氨基酸，发酵液pH和铵离子浓度存在着显着差异，而Val脱氢酶活性都增加了2～3倍。添加Val使菌体在60h之前糖耗速率加快，达到/(L·h)，胞内丙酮酸积累，丙酮酸羧化酶活性增加20%～95%，柠檬酸合成酶活性降低41%，发酵液中丙酸和丁酸出现先增加后降低的现象，最终效价比对照高出%，而总异戊酰组分则降低了23%，其他酰化组分降低了%；添加Ile以后菌体糖耗速率降至对照的30%～40%，柠檬酸合成酶活性降低了47%，发酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出现大量积累的现象。最终效价为对照的85%，而丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素以及异丁酰螺旋霉素组分含量分别增加126%、50%、296%。添加Leu对初级代谢影响不大，异戊酸在胞外积累，随后被重新吸收利用，最终异戊酰基螺旋霉素II和异戊酰基螺旋霉素III组分分别提高了41%和50%。同时总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了%，效价和对照基本一致。

【关键词】必特螺旋霉素；缬氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；有机酸；铵离子

ABSTRACTThispaperdemonstratedthatsupplementingvaline(L-Val),isoleucine(L-Ile)andleucine(L-Leu)insyntheticmediahaddifferenteffectsonbiosynthesisofmulti-componentsofbiotechspiramycin.Theresultsshowedthatthesupplementof/100mlaminoacidsafter36hoffermentationresultedindifferentpHvaluesandammoniumionconcentrationsoffermentationbroth,and2to3time-increaseoftheactivityofvalinedehydrogenase.Within60hafterthesupplementofL-Val,theglucoseconsumptionratewasincreasedtog/(100ml·h),pyruvicacidwasaccumulatedinsidethecells,theactivityofpyruvatecarboxylase(PC)wasincreasedintherangeof20%～95%,theactivityofcitratesynthase(CS)wasdecreasedby41%,thepropionicacidandbutyricacidinthefermentationbrothwereincreasedatfirstandthendecreasedwiththeultimatebiologicaltiterofbiotechspiramycinbeing%higherthanthatofthecontrolgroup,therelativecontentoftotalisovalerylspiramycincomponentsweredecreasedby23%,andtherelativecontentofotheracylatedcomponentswasdeclinedby%.AfterthesupplementofL-Ile,theglucoseconsumptionratewasdecreasedto30%～40%thenthatofthecontrolgroup,theactivityofCSwasdecreasedby47%,largeamountsofaceticacid,propionicacidandbutyricacidinthefermentationbrothwereaccumulatedinthecellswiththeultimatebiologicaltiterofbiotechspiramycinbeing85%(ofthat)ofthecontrolgroup,andtherelativecontentofpropionylspiramycinIII,acetylspiramycinandisobutyrylspiramycincomponentwereincreasedby126%,50%and296%respectively.However,L-Leuhadnoobviouseffectonprimarymetabolismofbiosynthesisofbiotechspiramycin.AfterthesupplementofL-Leu,extracellularisovalericacidwasaccumulatedinvitroandthenreabsorbedforeutilization,theultimaterelativecontentofisovalerylspiramycinII,isovalerylspiramycinIIIwasincreasedby41%and50%respectively,andtherelativecontentoftotalisovalerylspiramycinsincreasedby%withthebiologicaltiterofbiotechspiramycinbeingequaltothatofthecontrolgroup.

KEYWORDSBiotechspiramycin;Valine;Leucine;Isoleucine;Organnicacid;Ammoniumions

必特螺旋霉素是一种新型大环内酯类抗生素［1］，它是在螺旋霉素的基础上，通过4“-O-异戊酰基转移酶的催化在4”-O位置上接入一系列酰基形成的一族多组分酰化螺旋霉素()，于2000年10月获得中国发明专利(专利号：)，并于2001年7月获得国家药品监督管理局颁发的“新药临床研究批件”，现在已经通过II期临床研究。必特螺旋霉素组分中异戊酰组分含量对其生物活性影响较大，且在专利中对异戊酰基螺旋霉素III的含量要求为30%，发酵后生产工艺对异戊酰基螺旋霉素III的含量要求为20%。药效研究表明，必特螺旋霉素体外抗菌谱较广，在体内的稳定性比较好，毒性低，药效与乙酰螺旋霉素相似［2］。

氨基酸既可以作为碳源，也可以作为氮源来利用，而且许多氨基酸还是一些次级代谢产物的前体，如缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)，它们的代谢产物包括乙酰CoA、丙酰CoA、异戊酰基CoA与丁酰CoA等，这些物质是大环内酯类抗生素生物合成的前体。前人已经对支链氨基酸代谢影响抗生素生物合成以及相关酶学做了较多研究。

Hafner等［3］在研究avermectin生物合成过程中发现不含有支链-2-氧基脱氢酶活性的突变菌株无法在不含Val、Leu和Ile的合成培养基中生长。进一步研究发现支链-2-氧基脱氢酶负责支链氨基酸分解代谢，满足生长的需要还为avermectin生物合成提供起始单元-支链有机酸。Lounes等［4］在螺旋霉素发酵过程中研究了Val和铵离子之间的作用关系，结果表明在合成培养基中添加Val能够解除铵离子抑制，很大程度提高螺旋霉素的产量，同时还发现过量的铵离子抑制了酮异戊酸脱氢酶活性，导致Val无法分解代谢为螺旋霉素生物合成所需的前体物质。张秀华［5］在研究含有麦迪霉素4“-羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌时发现，在发酵24h时添加%的L-Ile，酰化螺旋霉素的百分含量从对照的45%提高到了67%。Yoshida等［6］报道Ile能增加醌霉素B(quinomycinB)组分的相对含量，并证明了Ile可以作为醌霉素生物合成的前体物质，调控醌霉素的合成。Pospisil等［7］发现莫能星(为五环单羧酸多醚结构的脂溶性抗生素，由4个相似的A、B、C、D成分构成)发酵过程中添加Ile能够提高莫能星B，降低莫能星A的相对比例，通过13C原子示踪实验发现，Ile抑制Val的生物合成，而Val为莫能星A提供前体，最终导致莫能星A相对比例下降。

本文主要在合成培养基的基础上研究支链族氨基酸对必特螺旋霉素组分和效价的影响。研究发现，在36h时分别添加/100ml的Val、Leu和Ile对必特螺旋霉素组分和效价影响最明显，并通过有机酸和酶活数据初步阐明了这三种氨基酸的作用机制。

1材料和方法

菌种、培养基和培养条件

(1)菌株必特螺旋霉素基因工程菌WSJ-1-195为含异戊酰基转移酶基因的整合型的螺旋霉素链霉菌(StreptomycesspiramyceticusF21)，由同联集团上海生物技术研究所提供。

(2)培养基斜面培养基、种子培养基和生物检定培养基均按文献［8］配制。

合成培养基成分(g/100ml)：糊精5，NH4NO3，KH2PO4，CoCl2，MgSO4，NaCl，CaCO3。

(3)培养条件将1ml甘油管接种于一级摇瓶，28℃培养48～56h，按10%接种量接种于二级种子摇瓶中，28℃培养24～26h，按8%接种量接种于发酵摇瓶(装液量50ml/500ml)中，220r/min，28℃旋转式摇床培养96h。每天定时取样测定各种发酵代谢参数，测定结果为3个样的平均值。

(4)氨基酸添加方式称取一定重量的Val、Leu和Ile在紫外灯下照射12h，并于发酵进行到36h时分别在不同的摇瓶中添加/100ml的Val、Ile、Leu。

试剂和仪器

乙酸、丙酸、丙酮酸、丁酸和异戊酸均为分析纯；Val、Leu、Ile、牛血清白蛋白为生化试剂；色谱仪为AgilentHP1100(检测器：G1314A紫外可见波长检测器；进样器：G1328A)；酶标仪为ThermoMK3(ElectronCorporation)。

测定方法

(1)生物量测量采用测量菌丝干重法(Drycellweight,DCW)。取5ml发酵液，过滤后用蒸馏水洗菌体，连同滤纸于80℃烘至恒重后称量。

(2)总糖、还原糖测定采用斐林试剂法［9］。

(3)铵离子浓度测量采用Berthelot比色法［10］。

(4)以杯碟法［8］测生物效价，乙酰螺旋霉素为标准品，枯草芽孢杆菌作为鉴定菌。

(5)产物组分以及胞外有机酸测定。

HPLC法测定有机酸

乙酸、丙酸、丙酮酸和α-酮戊二酸色谱柱：AquaSep(250mm×，5μm)，流动相为/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节pH至±)∶甲醇(∶)，流速1ml/min，进样量20μl，检测器波长210nm，柱温30℃。

丁酸和异戊酸色谱柱：Shim-packVP-ODS(150mm×，5μm)，流动相为/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节pH至±)∶甲醇(60∶40)，流速1ml/min，进样量20μl，检测器波长210nm，柱温30℃。

HPLC分析发酵样品取必特螺旋霉素发酵液于3000r/min离心10min，取上清液于-20℃冷冻保存备用。分析时取1ml上清液l0000r/min离心10min，上清液用μm合成纤维素酯膜进行真空过滤后，取20μl进样。按照文献［11］对发酵液中的有机酸定性，并对照有机酸标准曲线对有机酸进行定量。

(6)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶活力测定

无细胞粗提液的制备4℃冷冻离心(4000r/min，5min)收集菌体，用10%(M/V)的蔗糖溶液清洗两次后，悬浮于5ml的含20%甘油的/LTris-HCl缓冲液()中，用高压破碎仪(JG-1A)破碎，操作压力200Mpa。破碎液在4℃、12000r/min下离心30min，取上清液进行酶活测定。

酶活测定丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶分别按照文献测定按文献［12，13］的方法进行，一个酶活单位定义为1min内酶催化产物生成的微摩尔数，比活力用每毫克蛋白中所含酶活单位表示。采用酶标仪实时跟踪检测。蛋白质测定用考马斯亮蓝G-250法［10］，以牛血清白蛋白作标准曲线。

2结果

Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素产量的影响

在必特螺旋霉素发酵过程中添加Val、Ile与Leu，对必特螺旋霉素的菌体生长以及生物合成影响显着。显示，对数生长期结束后菌浓有所波动，在48～72h内呈现略微的上升趋势；在发酵后期，由于培养基中养分的耗尽，菌体发生自溶，菌浓下降。添加氨基酸之后，菌体在产素期的生长和维持受到了抑制，菌浓较对照低1%～5%。

表明，添加氨基酸之后的24h内效价增长缓慢，随着发酵的进行，各组分间差异性越来越明显。添加Val的摇瓶生物效价在60h以后呈现直线上升，发酵结束时比对照高出%。添加Ile以后生物效价增长比较缓慢，发酵结束时只有对照的85%。添加Leu其生物效价和对照基本相同。

Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素组分的影响结果显示，添加Leu以后，异戊酰基螺旋霉素II和异戊酰基螺旋霉素III分别为对照的141%和150%，总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了%，螺旋霉素比例很明显地下降。其他小酰化组分的相对含量和对照基本相同。

添加Ile促使丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素III以及异丁酰螺旋霉素Ⅱ组分含量分别增加126%、50%、296%；螺旋霉素和总异戊酰螺旋霉素的相对含量都相应地下降，分别是对照的64%和70%。

添加Val促进了螺旋霉素和丁酰螺旋霉素组分的合成，其中螺旋霉素I和III增加最为明显，酰化螺旋霉素组分则不同程度地降低，其中总异戊酰组分降低23%，其他酰化组分降低%。

由此可见，虽然三种支链氨基酸降解以后产生的都是必特螺旋霉素合成前体，但对于必特螺旋霉素组分和效价的影响很不相同。Val主要是通过促进内酯环的合成从而提高效价；Ile主要是促进了除异戊酰组分以外的其他酰化组分的合成；Leu主要是促进了异戊酰螺旋霉素的合成。

Val、Ile及Leu对糖代谢的影响

表明，添加Val以后并没有引起培养基pH的升高；而添加Leu和Ile之后培养基的pH一直高于对照。发酵液中的铵离子()变化表明，添加Ile和Leu以后发酵液中的铵离子分别为和/L，之后铵离子浓度略微下降。添加Val以后发酵液中的铵离子浓度和对照基本一致，始终维持在1mmol/L左右。

上述实验结果表明，螺旋霉素链霉菌对这三种氨基酸的利用和代谢有所不同。

如(A)显示，在添加Val的情况下，菌体的糖耗增加，发酵液中残留的总糖在48～60h之内迅速地从/100ml下降至/100ml；糖耗速率在48～60h也达到最高［/(L·h)］；添加Ile，糖耗速率维持在～/(L·h)；添加Leu以后糖耗速率在～/(L·h)范围内。

(B)所示为添加Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成过程中胞内丙酮酸变化情况。添加Val，胞内丙酮酸在～/L范围内波动；添加Ile，胞内的丙酮酸浓度在～/L范围内波动；添加Leu，胞内的丙酮酸浓度在～/L范围内波动。与对照～/L比较，发现添加Val时，胞内丙酮酸的生成浓度明显高于对照，添加Ile抑制胞内丙酮酸的生成，添加Leu时胞内丙酮酸的浓度与对照基本相同。葡萄糖进入细胞以后，首先经过EMP代谢途径转化为丙酮酸以后才能进一步进入TCA循环，丙酮酸浓度的变化一定程度上可以反映菌体对糖的利用情况。添加Val以后胞内的丙酮酸浓度高于对照，对EMP途径有一定的促进作用，相对应的糖的利用也得到了加强。同样，添加Ile引起了丙酮酸的降低，添加Leu没有引起丙酮酸的变化，但导致了对糖利用速率的不同。

描述了添加三种氨基酸时丙酮酸羧化酶与柠檬酸合成酶活性变化情况。丙酮酸羧化酶作用是丙酮酸转化生成草酰乙酸，其活性可以在一定程度上反映大环内酯类抗生素内酯环合成的强弱，即次级代谢的强弱，而柠檬酸合成酶是TCA循环的关键酶，其活性高低可以反映TCA循环的的强弱，与菌体初级代谢的强弱有直接的关系。

(A)显示示，添加Val后，丙酮酸羧化酶活性在48和60h的酶活分别是对照的120%和195%；添加Ile后，PC降为对照的为60%和65%；添加Ile没有发生明显的变化。(B)显示，添加Val后，柠檬酸合成酶活性在48和60h的分别是对照的42%和23%；添加Ile时，CS分别为对照的47%和52%；而添加Leu没有发生明显的变化。

由上可知，添加Val后，丙酮酸羧化酶的活性和胞内丙酮酸浓度都有明显提高。胞内生成的丙酮酸主要是转化为乙酰CoA和草酰乙酸，而草酰乙酸为生成丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA的主要底物，丙酮酸羧化酶的活性和胞内丙酮酸浓度的增加为菌体产素提供了充足的前体，提高了效价。

添加Ile时，丙酮酸羧化酶与柠檬酸合成酶的活性都极大降低，胞内丙酮酸的浓度也有所降低，也就是说Ile的加入同时削弱了菌体初级与次级代谢，导致了生物量与效价的降低。

当添加Leu时，丙酮酸羧化酶与柠檬酸合成酶的活性相对于对照都基本没有变化，初级与次级代谢都没有受到很大的影响，因此效价与对照相比也没有产生很大的变化，但是总异戊酰螺旋霉素组份的含量却大大提高了(尤其是异戊酰螺旋霉素III的含量)。

Val、Ile及Leu对胞外短链脂肪酸前体的影响

必特螺旋霉素是由短链脂肪酸单体经聚酮合成酶头尾缩合而成。必特螺旋霉素内酯环的生物合成需要8个前体［5个乙酸，1个丙酸，1个丁酸和1个未知前体(二碳单位)］，这些短链脂肪酸的浓度对必特螺旋霉素生物合成有较大影响。

(A)显示，添加了Val和Ile使胞外乙酸浓度迅速增加，且呈现不断上升的趋势。添加了Leu对乙酸浓度变化影响不大，乙酸在72h以后才出现积累。

丙酸变化如(B)，添加Leu以后，胞外的丙酸水平和对照基本上相似；添加Ile以后，丙酸出现了一段时间的积累，达到/L，之后小幅下降，最终发酵结束时丙酸水平和Leu差不多，都要高于对照。添加了Val之后丙酸缓慢增加，并在72h达峰值27mmol/L，随后又逐渐下降，发酵结束时要低于对照。

异戊酸的变化趋势如(C)所示，添加Leu以后胞外异戊酸浓度急剧增加，在84h达到最大值/L，随后下降为/L。添加Val和Ile以后异戊酸浓度略底于对照。

丁酸变化趋势如(D)所示，添加Val以后丁酸增加到14mmol/L，48h后迅速降低，维持在～/L范围内变化。添加Ile以后丁酸浓度始终高于对照，大约维持在13～19mmol/L。Leu的变化趋势和对照基本相似。

添加Val促进了糖耗速率，丙酮酸羧化酶活性变化以及乙酸数据都表明，添加Val可以促使胞内生成的丙酮酸转化为草酰乙酸。草酰乙酸参与丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA的合成，不仅提供了内酯环合成所需要的三碳前体，同时还可能缓解底物抑制效应，使多余的二碳前体(如乙酰CoA和丙酰CoA)能够在酰基羧化酶的作用下进一步转化成为丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA，促进大环合成，提高生物效价。

添加Ile后，其分解代谢物以乙酸、丙酸的形式分泌到胞外，且丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素II以及异丁酰螺旋霉素的含量明显提高。添加Ile后效价下降和非异戊酰等其他酰化组分提高，说明尽管Ile代谢提供了许多的二碳和三碳单位(乙酰CoA和丙酰CoA)，但是这些前体无法有效的进一步转化为内酯环合成的直接前体(如丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA)，而是结合到4”位。

添加Leu对乙酸、丙酸变化趋势没有显着影响，只有丁酸出现了少量的积累，效价也没有发生很大的变化，而异戊酰基螺旋霉素组分的相对比例得到了很大程度的提高，说明Leu经过分解代谢以后产生的异戊酰基CoA也可以作为螺旋霉素4”的侧链前体。

3讨论

大环内酯类抗生素的内酯环的形成需要乙酸、丙酸、和丁酸作为前体物质。这些前体物质主要来源于糖酵解途径、三羧酸循环、脂肪酸以及氨基酸代谢(螺旋霉素生物合成途径见)，在初级代谢与次级代谢之间扮演着极其重要的角色，是联系初级代谢与次级代谢的桥梁。本文主要考察Val、Ile和Leu的添加为必特螺旋霉素的生物合成提供了直接的前体，同时还不同程度干扰了菌体的代谢。

菌体细胞对这三种氨基酸不同的氨基利用方式造成了对糖代谢的差异。在本实验中，菌体对这三种氨基酸的利用情况是有所不同的。首先我们发现，添加Val以后并没有引起培养基pH的升高，而添加Leu和Ile之后培养基的pH却一直要高于对照()。通过

Centralmetabolicmapof

考察发酵液中的铵离子浓度()的变化，添加了Ile和Leu以后发酵液中的铵离子浓度与添加了Val后铵离子浓度也有明显差异，而添加以后发酵液中的铵离子浓度和对照基本一致。Voelker等［14］认为，Val被吸收以后经过第一步的转氨反应，将Val的氨基部分继续利用，剩下的碳骨架(即α-酮基异戊酸)被暂时分泌出到培养基中，在细胞中的铵离子耗尽以后，α-酮基异戊酸又被重新吸收利用。菌体对Leu和Ile是通过脱氨作用先将氨基部分分泌出胞外之后直接利用氨基酸的碳骨架。

研究发现，添加支链氨基酸未能引起菌浓的增加，而是经过代谢转变为必特螺旋霉素生物合成的前体。通过计算，加入的三种氨基酸完全分解形成相应的CoA大约是合成必特螺旋霉素所需量的5～10倍，因此，其分解代谢产物为必特螺旋霉素生物合成所提供的前体是完全充足的。如果这些短链脂肪酸前体无法转化为内酯环所需的直接前体(甲基丙二酰CoA、丙二酰CoA和乙基丙二酰CoA)，则在胞内产生积累，最终以短链脂肪酸的形式分泌出胞外()，必特螺旋霉素内酯环的生物合成也无法顺利进行，效价也无法提高。

添加Val，经过转氨反应可能在一定程度上刺激了糖代谢系统的酶活［15］，加快了菌体对糖的利用，为内酯环的合成提供碳源。Val还可以通过以谷氨酰胺合成酶为中心的转氨基反应为必特螺旋霉素内酯环糖苷侧连提供N原子［16］。丙酮酸羧化酶活性变化以及乙酸数据()表明，添加Val可以促使胞内生成的丙酮酸转化为草酰乙酸。草酰乙酸参与丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA的合成，不仅提供了内酯环合成所需要的三碳前体，同时还可能缓解底物抑制效应，使多余的二碳前体(如乙酰CoA和丙酰CoA)能够在酰基羧化酶的作用下进一步转化成为丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA［16］，促进大环合成。发酵过程中也出现发酵液中丙酸、丁酸先积累再利用的现象，重新利用的有机酸主要促使内酯环的合成，因此，添加Val促进了必特螺旋霉素生物效价的提高。添加Val促进丁酰螺旋霉素组分也有一定程度的增加，可能是由于丁酰基侧链来自Val，Venzina等［17］在柱晶白霉素生物合成过程中也证明了这一点假设。

添加Ile对菌体的糖耗速率下降，必特螺旋霉素生物效价有明显的抑制，但是丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素II以及异丁酰螺旋霉素的含量有明显的增加。由于TCA循环中的甲基丙二酰CoA消旋酶和异构化酶易受到Ile的抑制［18］，因此，TCA循环中产生的琥珀酰CoA

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