昆医分生基因治疗不考试

What

isGeneTherapy?Genetherapyistheintroductionofgeneticmaterialintocellsfortherapeuticpurposes

Onemajorgoalofgenetherapyistosupplycellswithhealthycopiesofmissingorflawedgenes本文档共64页；当前第1页；编辑于星期二\16点8分基因治疗概况基因治疗，是基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预，是一种以预防和治疗疾病为目的的人类基因转移技术。即：以改变细胞遗传物质为基础的生物医学治疗。基因治疗概况本文档共64页；当前第2页；编辑于星期二\16点8分基因研究与治疗发展历程发现DNA双螺旋结构建立DNA重组技术在大肠杆菌中成功表达胰岛素第一个基因工程药物重组人胰岛素上市美国批准第一个体细胞基因治疗方案，治疗严重综合性免疫缺损症英国培养出第一只克隆羊多莉人类基因组计划“工作草图”绘制完毕基因治疗产品上市19531973197819821990199720002004本文档共64页；当前第3页；编辑于星期二\16点8分

基因治疗的发展史及研究概况

1967年Nirenbeg首先提出基因工程可用于人类疾病治疗的设想。1980年Cline首次将外源基因转导入小鼠获得成功，次年对2名重症β-地中海贫血患者进行治疗，虽未获成功，1985年美联邦国家卫生研究院(NIH)成立了基因治疗委员会，并于1989年首次批准Arderson等将抗新霉素基因导入黑色素瘤患者的肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)作为标记基因。1990年Blaese将正常人的腺苷脱胺酶基因导入2名腺苷胱氨酸（ADA）缺乏症患者的淋巴细胞获得成功，成为医学史上的重要里程碑。1991年Szczylik等在小鼠慢粒白血病模型上，将反义寡核苷酸导入肿瘤细胞，阻断了癌细胞的增殖.在我国，1991年12月复旦大学遗传研究所与第二军医大学长海医院合作，以携带凝血因子IX基因的反转录病毒作为载体，对两例血友病B患者进行了首次基因治疗。本文档共64页；当前第4页；编辑于星期二\16点8分恶性肿瘤心血管疾病遗传病感染性疾病威胁人类健康的重大疾病基因治疗对象基因治疗概况本文档共64页；当前第5页；编辑于星期二\16点8分基因治疗药与基因工程药DNAPROTEINRNA基因工程药基因治疗药基因治疗概况本文档共64页；当前第6页；编辑于星期二\16点8分治疗基因载体靶细胞基因治疗制品基因治疗要素基因治疗概况本文档共64页；当前第7页；编辑于星期二\16点8分最理想的方式目前的主要方式基因治疗策略基因治疗概况

基因替代（GeneReplacement）基因修复（GeneModification）基因添加（GeneAddition）基因失活（Geneblock）本文档共64页；当前第8页；编辑于星期二\16点8分本文档共64页；当前第9页；编辑于星期二\16点8分本文档共64页；当前第10页；编辑于星期二\16点8分本文档共64页；当前第11页；编辑于星期二\16点8分本文档共64页；当前第12页；编辑于星期二\16点8分本文档共64页；当前第13页；编辑于星期二\16点8分本文档共64页；当前第14页；编辑于星期二\16点8分体细胞基因治疗生殖细胞基因治疗基因治疗种类基因治疗概况本文档共64页；当前第15页；编辑于星期二\16点8分基因治疗的途径因受体细胞的不同分为两种：①生殖细胞基因治疗(germcellgenetherapy)：是将正常外源基因转移到患者的生殖细胞(精细胞、卵细胞及中早期胚胎)中，使子代成为正常的个体。由于此法改变了生殖细胞的遗传物质，影响人类基因构成，并影响到子代的发育，同时涉及一系列的伦理问题，美联邦国家卫生研究院(NIH)目前规定禁止用于人类，仅可用于动物实验研究。②体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)：是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，从而达到治疗目的。由于该疗法只涉及体细胞的遗传改变，而不影响子代，故到目前为止，人类所进行的基因治疗，均为体细胞基因治疗本文档共64页；当前第16页；编辑于星期二\16点8分本文档共64页；当前第17页；编辑于星期二\16点8分体外基因治疗(Exvivo)：从病人体内获取细胞，体外培养并进行基因转移后，重新输入患者体内前列腺癌细胞转染细胞因子基因后回输到患者体内，肿瘤转移灶被T细胞及NK细胞附着。基因治疗途径基因治疗概述本文档共64页；当前第18页；编辑于星期二\16点8分体内基因治疗(Invivo)：直接将基因或改造后的病毒(插入目的基因)导入人体患病组织中携p53基因的重组腺病毒导入人体肿瘤组织引起肿瘤细胞裂解基因治疗途径基因治疗概况本文档共64页；当前第19页；编辑于星期二\16点8分基因治疗的要求是：①向一定的细胞导入治疗基因；②输送到细胞核，并整合到DNA的正确位置；③稳定的表达，包括转录、翻译、定位和修饰。本文档共64页；当前第20页；编辑于星期二\16点8分基因治疗的途径本文档共64页；当前第21页；编辑于星期二\16点8分选择靶细胞的原则是：①必须较坚固，足以耐受处理，易于由人体分离并便于回输。②具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月甚至几年，最好可延续至病人的整个生命期。③易于受外源性物质的转化。

目前使用较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。肿瘤基因治疗常用的靶细胞是肿瘤细胞自身，其次是淋巴细胞和造血干细胞。本文档共64页；当前第22页；编辑于星期二\16点8分基因转染/转导的方法本文档共64页；当前第23页；编辑于星期二\16点8分基因转移方法分三类：①化学法：包括磷酸盐沉淀、脂质体(Plasmid-liposomecomplex)包埋、多聚季铵盐和DEAE-葡萄糖等化学试剂转移。这些方法通过改变细胞膜的通透性或增加DNA与细胞的吸附而实施基因转移。②物理法：包括电穿孔、显微注射、裸露DNA直接注射、颗粒轰击等。物理方法转移的遗传物质，在细胞内易受DNA酶降解，不易稳定地存在于细胞基因中。③生物法：生物法主要是指病毒介导(以病毒为载体)的基因转移。包括DNA病毒如腺病毒(AV)、腺病毒相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、细小病毒(HI)、痘苗病毒(VV)和RNA病毒即反转录病毒(RV)。本文档共64页；当前第24页；编辑于星期二\16点8分生物传导的方法本文档共64页；当前第25页；编辑于星期二\16点8分Adenovirusesentercellsbyreceptor-mediatedendocytosis:Bindingofviralcoatproteintoaspecificreceptorontheplasmamembraneofcellsisfollowedbyendocytosis,aprocessinwhichtheplasmamembraneinvaginatesandthenpinchesofftoformanintracellularvesicle(endosome).SubsequentvesicledisruptionbyadenovirusproteinsallowsvirionstoescapeandmigratetowardsthenucleuswhereviralDNAentersthroughporesinthenuclearenvelope.AdaptedfromCuriel(1994)withpermissionfromtheNewYorkAcademyofSciences本文档共64页；当前第26页；编辑于星期二\16点8分Genetransferviathereceptor-mediatedendocytosispathway.ThenegativelychargedplasmidDNAcanbindreversiblytothepositivelychargedpolylysineattachedtothetransferrinmolecule.Duringthisprocess,theDNAiscondensedintoacompactcirculartoroidwiththetransferrinmoleculeslocatedexternallyandfreetobindtocellsurfacetransferrinreceptors.Followinginitialendosomeformation,aportionoftheendocytosedconjugatescanmigratetothenucleus,althoughaverysignificantfractionisalternativelytransferredtolysosomeswheretheDNAisdegraded.TheefficiencyoftransfercanbeincreasedbythefurtherrefinementofcouplinganinactivatedadenovirustotheDNA

transferrincomplex:followingendocytosisandtransporttolysosomes,theaddedadenoviruscausesvesicledisruption,allowingtheDNAtoavoiddegradationandtosurviveinthecytoplasm.AdaptedfromCuriel(1994)withpermissionfromTheNewYorkAcademyofSciences.本文档共64页；当前第27页；编辑于星期二\16点8分Invivoliposomegenedelivery.(A)and(B)Structureofliposomes.Liposomesaresyntheticvesicleswhichcanformspontaneouslyinaqueoussolutionfollowingartificialmixingoflipidmolecules.Insomecases,aphospholipidbilayerisformed,withhydrophilicphosphategroupslocatedontheexternalsurfacesandhydrophobiclipidslocatedinternally(left).Inothercasesthereisamultilamellarlipidenvelope.AnionicliposomeshaveanegativesurfacechargeandwhenthelipidconstitutentsaremixedwithnegativelychargedDNAmolecules(seepanelCbelow),theDNAisinternalized.CationicliposomeshaveasurfacepositivechargeandDNAmoleculesbindtothesurfaceofliposomes.(C)Useofliposomestotransfergenesintocells.ThisfigureillustratestheuseofanionicliposomestotransferinternallylocatedDNAintocells.Theplasmamembranesofcellsarefluidstructureswhoseprincipalcomponentsarephospholipids,andsomixingofcellsandliposomescanresultinoccasionalfusionbetweenthelipidbilayeroftheliposomeandtheplasmamembrane.Whenthishappenstheclonedgenescanbetransferredintothecytoplasmofacell,andcanthencemigratetothenucleusbypassivediffusionthroughtheporesofthenuclearenvelope.Notethat,inpractice,cationicliposomeshavebeenmorewidelyusedfortransferringDNAintocells.本文档共64页；当前第28页；编辑于星期二\16点8分基因的整合途径本文档共64页；当前第29页；编辑于星期二\16点8分Exogenousgenesthatintegrateintochromosomescanbestablytransmittedtoalldaughtercells,unlikeepisomal(extrachromosomal)genes.Thefigureillustratestwopossiblefatesofgenesthathavebeentransferredintonucleatedcells.Genetherapyinvolvingchromosomalintegrationofexogenousgenesoffersthepossibilityofcontinuedstableexpressionoftheinsertedgeneandapermanentcure,butcarriescertainrisks,notablythepossibilitythatoneoftheintegrationeventsmayresultincancer.Bycontrast,episomalgeneswhichdonotintegratebutreplicateextrachromosomally(underthecontrolofavectororiginofreplication)maynotsegregatetoalldaughtercellsduringsubsequentmitoses.Asaresult,thistypeofapproachhasbeenparticularlyappliedingenetherapieswherethetargettissueconsistsofnondividingcells。本文档共64页；当前第30页；编辑于星期二\16点8分基因转导的载体本文档共64页；当前第31页；编辑于星期二\16点8分转运载体要求：①能够高效转运治疗所需的一个或多个目的基因；②载体具有准确的靶向性，无免疫原性，易于生产、提纯；③无致病性，对受者及环境无危害；④使其所携带的基因能按要求准确表达。理想载体目前仍无法得到。病毒为载体介导的基因转移具有靶向性好、效率高的特点，另外可利用细胞自身机制生产所需要的目的蛋白质，是目前进入临床前期研究的较为理想的载体之一。本文档共64页；当前第32页；编辑于星期二\16点8分目前适用基因治疗的疾病⑴遗传性疾病，首选单基因缺陷症如镰状细胞病、甲型和乙型血友病、地中海贫血、ADA缺乏所致重症联合免疫缺陷病、嘌呤核苷磷酸化酶PNP缺乏症、遗传性α1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊性纤维化等。⑵免疫缺乏病，如白细胞粘附分子缺陷病、TcR-CD3缺乏症。⑶肿瘤及恶性血液病，主要适用于基因突变者如膀胱癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤、白血病等。⑷其他疾病如糖尿病、肌营养不良、高血压、某些精神病、AIDS、慢性活动型肝炎、心血管疾病等。本文档共64页；当前第33页；编辑于星期二\16点8分单基因疾病的基因治疗本文档共64页；当前第34页；编辑于星期二\16点8分Exvivogeneaugmentationtherapyforadenosinedeaminase(ADA)deficiency.

Notethatidentificationofsuitablytransformedcellsishelpedbyhavinganappropriateselectablemarkerintheretrovirusvector,suchasaneoRgenewhichconfersresistancetotheneomycinanalogG418.Followinginfection,thetargetcellscanbeculturedinamediumcontainingG418toselectforthepresenceofretroviralsequences,andthenassayedbyPCRforthepresenceoftheinsertedADAgene.SuitableADA+cellscanthenbeexpandedinculturebeforebeingreintroducedintothepatient.

本文档共64页；当前第35页；编辑于星期二\16点8分

Examplesofgenetherapytrialsforinheriteddisorders

DisorderCellsalteredGenetherapystrategyADAdeficiencyTcellsandhemopoieticstemcellsExvivoGATusingrecombinantretrovirusescontaininganADAgeneCysticfibrosisRespiratoryepitheliumInvivoGATusingrecombinantadenovirusesorliposomestodelivertheCFTRgeneFamilialhypercholesterolemiaLivercellsExvivoGATusingretrovirustodelivertheLDLreceptorgene(LDLR)Gaucher'sdiseaseglucocerebrosidaseHemopoieticstemcellsExvivoGATusingretrovirusestodeliverthegene(GBA)GAT,geneaugmentationtherapy.

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直接基因水平治疗；副作用小；技术含量高，生产成本低；病毒液性质稳定；生产简单可靠，无环境污染。基因治疗的优势基因治疗概况本文档共64页；当前第37页；编辑于星期二\16点8分

1990年,美国W.F.Anderson严重复合免疫缺陷病SCID4岁女孩，AshantiDesilva13岁，正常生活第一项体细胞基因治疗临床试验基因治疗概况本文档共64页；当前第38页；编辑于星期二\16点8分两项新措施：（1）制定了基因治疗临床试验监查计划；（2）定期开办基因治疗安全性专题研讨会。并否决了一项由少数激进分子提出的“停止基因治疗临床试验”议案。1999年9月17日，18岁的JesseGelsinger参加宾夕法尼亚大学治疗鸟氨酸甲酰氨基转移酶（OTC）缺乏症临床试验后死亡。美国Gelsinger事件调查结果：应只包括女性；血氨值已偏高；门静脉注射大剂量的重组腺病毒（1X1014VP）调查结论：临床试验存在违规行为，而与进行的基因治疗的制品本身无直接关系。基因治疗概况本文档共64页；当前第39页；编辑于星期二\16点8分巴黎NeckerEnfantsMalade医院采用逆转录病毒载体携带IL2RG/γc基因治疗重症联合免疫缺陷病（SCID-X1）的临床试验；1999.10起，9/10名儿童的免疫力得到了恢复；2002.10-2005.1，3/9例分别在近3年及5年后相继表现出T细胞白血病的症状法国“气泡儿童”事件法国政府立即终止了该项试验。美国FDA暂停了27项同类以逆转录病毒为载体基因治疗临床试验。英国则表示不会停止这类基因治疗临床试验。意大利的米兰，类似的临床试验仍在进行。研究表明IL2RG/γc基因本身有缺陷，导致白血病的发生。基因治疗概况本文档共64页；当前第40页；编辑于星期二\16点8分Bubble-boy基因治疗概况本文档共64页；当前第41页；编辑于星期二\16点8分基因治疗方案总数1309项腺病毒载体（最常用）331项（24.7%）

p53gene65项

Ad-p5362项

II/III&III期45项

其中：Ad-p53项目12项III期32项

其中：Ad-p53项目

6项截止2007年7月，全世界批准的基因治疗临床试验方案概况基因治疗概况本文档共64页；当前第42页；编辑于星期二\16点8分国际基因治疗研究概况-地理分布基因治疗概况Total1309

UpdatedJuly.2007本文档共64页；当前第43页；编辑于星期二\16点8分国际基因治疗研究概况-国家分布基因治疗概况本文档共64页；当前第44页；编辑于星期二\16点8分基因治疗概述国际基因治疗研究概况-目的基因本文档共64页；当前第45页；编辑于星期二\16点8分国际基因治疗研究概况-适应症基因治疗概况本文档共64页；当前第46页；编辑于星期二\16点8分国际基因治疗研究概况-载体基因治疗概况本文档共64页；当前第47页；编辑于星期二\16点8分国际基因治疗研究概况-临床分期基因治疗概述本文档共64页；当前第48页；编辑于星期二\16点8分国际基因治疗研究概况-年度状况基因治疗概述本文档共64页；当前第49页；编辑于星期二\16点8分国内基因治疗及相关研究概况基因治疗概况本文档共64页；当前第50页；编辑于星期二\16点8分基因治疗概况本文档共64页；当前第51页；编辑于星期二\16点8分人基因治疗研究和制剂质量控制指导原则基因治疗概况本文档共64页；当前第52页；编辑于星期二\16点8分基因诊断本文档共64页；当前第53页；编辑于星期二\16点8分基因诊断:是从基因水平阐明疾病的病因所在，是属于全新内容、全新技术和全新概念的实验室诊断方法。它是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷和表达异常，对人体健康状态和疾病作出诊断的方法和过程。本文档共64页；当前第54页；编辑于星期二\16点8分基因诊断的基本原理：是通过检测DNA或RNA的结构变化、量的多少及表达功能是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。基因诊断的临床意义：在于可以对疾病作出早期、确切的诊断，可以确定个体对疾病的易感性以及疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等。

近十年来，基因诊断技术已逐步成为实验诊断的常规技术，基因诊断的原理和技术已广泛应用于临床各个学科领域，包括遗传学、传染病学、肿瘤学、血液学、免疫学以及法医学等领域。本文档共64页；当前第55页；编辑于星期二\16点8分基因诊断的基本方法①基因突变的诊断；②多态性分析；③基因表达的检测；④外源DNA的检测。

本文档共64页；当前第56页；编辑于星期二\16点8分基因诊断中常用的分子生物学技术基因诊断中常用的技术主要包括：1、核酸分子杂交；2、DNA指纹3、聚合酶链式反应(PCR)；4、单链构象多态性检测(SSCP)；5、限制酶酶谱分析；6、DNA序列测序7、DNA芯片技术。本文档共64页；当前第57页；编辑于星期二\16点8分遗传性疾病基因诊断1.直接诊断直接诊断的前提是被检测基因必须已被克隆，基因的正常序列和结构已阐明。采用基因突变的诊断方法，通过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病发生的各种基因突变。2.间接诊断在许多情况下，疾病的致病基因尚未被克隆而无法进行直接诊断，但若致病位点已在基因组中被定位，则可以采用间接诊断策略。即采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺陷的染色体，