实验三-药物敏感试验和消毒灭菌

实验内容和要求1.掌握药敏试验的原理、步骤、结果及意义2.掌握常用的消毒与灭菌技术3.熟悉紫外线杀菌试验的原理4.了解细菌L型的诱导和菌落类型本文档共24页；当前第1页；编辑于星期二\1点17分一、药敏试验在感染性疾病防治中的意义

近年来，由于各种抗菌药物的广泛应用，导致耐药菌株的迅速增多。尤其是广谱及超广谱抗生素的普遍使用，造成耐药菌株大量出现，给临床治疗带来极大的困难。同时，由于不合理的使用抗生素，治疗的失败率及不良反应均有增加。因此，药敏试验在感染性疾病的防治方面具有日益重要的实际意义。2本文档共24页；当前第2页；编辑于星期二\1点17分二.培养+药敏的目的

1、确定导致感染的病原菌的种类，对于不同的病原菌（G-杆菌或G+球菌，条件致病菌或急性传染病病原菌）需要采取不同的治疗措施。

2、确定病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床根据病人情况合理用药。由于细菌耐药性的快速增长，单纯依赖经验选用药物经常无效，在更多的时候需要参考药敏实验的结果。

3、用于流行病学调查及院内感染的监控，减少耐药菌株的流行。3本文档共24页；当前第3页；编辑于星期二\1点17分三、什么情况下需要做培养+药敏？感染原因无法确定。病原菌的耐药性无法确定，经验用药可能失败（尤其是免疫力低下患者、长期使用抗生素者、ICU病房、院内感染患者、接受导管插入或其他创伤性治疗患者。）病人对可用药物过敏，需要检测其他药物的耐药性。病人个体情况要求对某些药物精确用药，需要测定其最低抑菌浓度（MIC）。 4本文档共24页；当前第4页；编辑于星期二\1点17分四、常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测方法介绍其原理：体外测定抗生素药物抑菌或杀菌的能力。可帮助临床对感染性疾病选择最佳用药，还可进行流行病学调查，了解某些致病菌耐药性变异情况。纸片扩散法（Kirby-Bauertest）稀释法（dilutiontest）E试验法（Etest）联合药物敏感试验特殊耐药菌及耐药酶的表型检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等本文档共24页；当前第5页；编辑于星期二\1点17分五、纸片扩散法（K-B法）原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。本文档共24页；当前第6页；编辑于星期二\1点17分方法：菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准；涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60º，最后沿平板内缘涂抹1周；贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm；孵育：35ºC16-18h，量取抑菌圈直径。本文档共24页；当前第7页；编辑于星期二\1点17分注意事项1纸片应分布均匀，中心距离不小于24mm。2含菌平板必须避免过浓或过稀。3纸片贴完后应在15min内将平板反过来，置于37度温箱中。4纸片一旦接触培养基就不应再挪动位置。5要注意无菌操作。本文档共24页；当前第8页；编辑于星期二\1点17分影响药敏结果的因素培养基应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。细菌接种量细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。药物浓度药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。培养时间一般培养温度和时间为37℃，8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2~4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。本文档共24页；当前第9页；编辑于星期二\1点17分结果判读：用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）标准判读结果；报告：细菌对该抗生素是敏感（susceptible，S）；耐药（resistant，R）；还是中介（intermediate，I）。本文档共24页；当前第10页；编辑于星期二\1点17分六、如何理解MIC值及药敏结果？

每种药物均提供定性和定量两种结果。定性：敏感（S）表示该药物对该细菌有抑制或杀灭作用。使用常规剂量可以达到有效的治疗效果。

中介（中度敏感，I）表示细菌对该药物治疗的敏感性低于敏感菌株，必须加大剂量以达到更高的血药浓度才能在特定的生理部位获得有效的临床效力；对于使用剂量有严格限制的药物则必须重复测试以确定敏感还是耐药。

耐药（R）表示药物常规剂量所达到的药物浓度不能抑制或杀死细菌，即使加大剂量也不能达到治疗效果或者超过了人体的正常耐受水平。定量：MIC（最低抑菌浓度）表示在体外达到抑制细菌生长所需要的最低的药物浓度。临床治疗要求的血药浓度一般为MIC值（μg/ml）的4-8倍。对于不同部位的不同药物，其浓度可能更高或更低。应具体情况具体分析，不可一概而论。

11本文档共24页；当前第11页；编辑于星期二\1点17分长期使用抗生素的病人应该怎样做药敏试验？

长期使用抗生素的病人尤其是住院病人应该经常做药敏试验。所谓的长期，并不是一个很长的时间概念，住院病人每隔3-4天就需要做一次细菌学检查。对于ICU病房的病人，可能每天都要做细菌学检查。因为这些病人多数免疫力较差，容易受条件致病菌的侵犯，而且反复发作。此外病原菌常呈多重耐药性，产超广谱β-内酰胺酶的G-杆菌（ESBL）以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA和MRSCN）、产AmpC酶的阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌在ICU病房最为常见。对于长期使用抗生素的病人，其感染有以下几个特点；

1.长期使用抗生素的病人，不同时期（即使在很短的时间内）感染的病原菌种类可能不同，耐药性因此也不相同。

2、同一株细菌，在长时间用药时，仅需要3-4天就可以从对某种药物敏感发展为耐药。

3.长期使用抗生素容易诱发细菌产生L型变异。常规培养阴性时，进行L型细菌培养能够提高检出率。12本文档共24页；当前第12页；编辑于星期二\1点17分形成条件：生物学特性：与医学关系：细胞壁中肽聚糖结构受理化或生物因素的直接破坏或合成抑制而形成。形态多形性；染色革兰阴性；培养高渗培养基；菌落油煎蛋样

仍有一定致病性细菌L型－细胞壁缺陷细菌临床分离葡萄球菌L型葡萄球菌L型回复后本文档共24页；当前第13页；编辑于星期二\1点17分灭菌－杀灭或除去所有微生物的繁殖体和芽胞。消毒－杀灭或除去病原微生物。防腐－抑制微生物的生长与繁殖。抑菌剂或防腐剂。除菌:用冲洗、过滤等机械手段除去微生物的方法化疗：用对病原菌有毒力但对机体无害的化学物质杀灭或抑制机体内病原微生物的方法消毒与灭菌技术

基本概念14本文档共24页；当前第14页；编辑于星期二\1点17分擦拭法高压蒸汽灭菌法常用消毒灭菌的方法物理法

化学法浸泡法熏蒸法喷雾法热力消毒法生物净化法辐射消毒法燃烧法烤箱法煮沸法干热法湿热法日光曝晒法紫外线灯照射法电子灭菌灯法电离辐射法本文档共24页；当前第15页；编辑于星期二\1点17分煮沸消毒法操作规程将物品刷洗干净，全部浸没在水中，或在水中加入碳酸氢钠配成1％一2％的浓度，可将沸点提高到105℃．还可去污防锈。加热煮沸。水沸后开始计时5—10min，如中途加入物品，则在第二次水沸后重新计时。关闭热源，用无菌持物钳取出消毒物品。本文档共24页；当前第16页；编辑于星期二\1点17分

焚烧----最彻底的灭菌方法烧灼----直接用火焰灭菌方法如接种环、试管口、三角瓶口干烤----加热160-170℃2h

玻璃器皿、陶瓷1、干热灭菌法红外线----热效应，与干烤类似灭菌效果：可杀死营养体和芽胞本文档共24页；当前第17页；编辑于星期二\1点17分2.湿热灭菌法高压蒸汽灭菌法（热压灭菌法）最有效的湿热灭菌法121℃15-20mim（杀芽胞)煮沸消毒法水煮100℃5mim(杀繁殖体)-2h(杀芽胞)流通蒸汽消毒法巴氏消毒法间歇蒸汽灭菌法水蒸汽100℃15-30mim(杀繁殖体)反复多次流动蒸汽间歇加热灭菌(杀芽胞）较低的温度61℃30mim/71℃30s（杀致病菌）效果比干热好本文档共24页；当前第18页；编辑于星期二\1点17分压力蒸汽灭菌的效果监测

物理监测法用150℃或200℃的留点温度计。使用前将温度计汞柱甩至50℃以下，放入包裹内，灭菌后检查其读数是否达到灭菌温度化学监测法主要是通过化学指示剂的化学反应，灭菌后呈现的颜色变化来辨别是否达到灭菌的要求。临床常用的化学指示卡与化学指示胶带，化学指示卡放在包的中央，化学指示胶带粘贴在包的外面。生物监测法是最可靠的监测法，利用对热耐受力较强的非致病性嗜热脂肪杆菌芽孢作为指示剂，制成每片含106个嗜热脂肪杆菌芽孢的菌纸片,使用时将10片菌纸片分别放于灭菌器四角及中央，待灭菌完毕，用无菌镊取出后．再放人培养基内，在56℃温箱中培养48h至1周，若全部菌纸片无细菌生长则表示灭菌合格。本文档共24页；当前第19页；编辑于星期二\1点17分消毒与灭菌技术

辐射灭菌法̶非电离辐射：紫外线最佳杀菌波长为250～270nm杀菌机理：干扰DNA的复制与转录

特点：紫外线穿透力较弱适应范围：紫外线消毒适用于空气消毒与物品表面的消毒。本文档共24页；当前第20页；编辑于星期二\1点17分消毒与灭菌技术

滤过除菌法杀菌机理：含有微细小孔<0.22μm,只允许液体或气体及孔径<0.22μm的颗粒通过，细菌不能滤过。不能除病毒、支原体适用范围：血清、毒素、输液、生物制品、抗生素以及空气等的除菌。本文档共24页；当前第21页；编辑于星期二\1点17分促进菌体蛋白质变性凝固（酚、醇、醛、酸碱类等）干扰细菌酶系统和代谢（氧化剂、重金属盐类等）损伤细菌细胞膜，增加其通透性（表面活性剂、脂溶剂等）菌体成分氧化、水解或结构改变（氧化剂、卤素、醛、酚等）消毒与灭菌技术

化学消毒剂作用机制本文档共24页；当前第22页；编辑于星期二\1点17分消毒剂类别名称浓度(%)用途重金属盐红汞2皮肤、粘膜、小创面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化剂高锰酸钾0.1皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒过氧化氢3皮肤、粘膜、创伤消毒过氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纤维消毒卤素类碘液2.5皮肤消毒醇类乙醇70～75皮肤、体温计消毒酚类石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒来苏3～5同上、也常用于手及皮肤消毒表面活性剂新洁尔灭0.1手术器械消毒酸碱类