DNA计算中荧光技术的应用及其发展

DNA计算中荧光技术的应用及其发展张成杨静王淑栋(北京大学信息科学技术学院，高可信度软件技术教育部重点实验室，北京100871)摘要：DNA计算作为前沿科学研究的重点和热点，已经从简单发展为复杂，从理论转化为应用。在这一过程中，反应速度快，变化灵敏的荧光标记技术发挥了重要的作用。本文围绕DNA计算和荧光标记技术两个方面进行说明。一方面，对近年来DNA计算中荧光技术的应用进行了总结：（1）荧光标记的表面计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术。（4）与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术。另一方面，介绍了几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。在今后的研究中，只有将这两者紧密结合，才能发挥DNA计算天然的优势。关键词：DNA计算；荧光标记技术；纳米技术；DNA分子；杂交1引言DNA由于其具有的特性，在大自然的进化中，被选择为稳定的遗传物质。在细胞中，DNA精细地编码并控制着整个细胞的新陈代谢。另一方面，DNA分子容易构成二级甚至三级结构。因此，DNA作为计算工具有着得天独厚的优势1,2。近年来，DNA计算领域发展迅速，尤其在DNA分子自组装、DNA纳米装置等方面3。然而伴随着DNA计算解决问题的规模增大和形式多样化，求解过程中DNA分子数量急剧增加以及DNA分子结构复杂性的加大，求解过程中实验过程繁琐且存在误差，使得DNA计算中解的标记和检测变得更加困难4。为了解决这一难题，荧光技术在DNA计算中逐渐得到了广泛的应用。荧光是指某些物质受到某种波长的光激发后，其原子中的电子被激发到较高能级，产生的发射光。荧光物质分子都具有刚性结构和共平面的π-π共轭体系。在激发态时，这种结构具有稳定性，可以持续数秒钟，从而有利于能量的转移5。DNA荧光技术在生物学领域中已经有很多应用，如近年来发展起来的DNA荧光标记、real-time检测技术、分子信标技术等。荧光标记DNA简单便捷，可以实时检测，而且灵敏度非常高，这些特点都使得其在DNA计算中具有广泛的应用前景。目前，结合荧光技术的DNA计算已经成为前沿研究热点。荧光技术在DNA计算中的应用主要有如下几类：（1）荧光标记的表面计算：通过DNA固定化和杂交技术，在固相表面通过荧光标记进行计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测：利用特定酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行计算。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术：巧妙利用DNA分子的三链甚至多链结构，通过加入引发链，来释放另一DNA链。（4）与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门：利用RNAi技术控制表达荧光蛋白，从而构建了多重逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术：在DNA自组装结构的基础上，结合了荧光标记技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术：通过DNA分子的不同状态，构建了可控的荧光纳米装置。近年来，荧光技术不仅应用于生物学本身，而且在DNA计算、信息学等诸多领域具有很大的应用潜力。下面有几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。相信随着DNA计算和荧光技术的发展，这两者必将紧密结合，使得DNA计算的种类和方法更加多样和成熟。2DNA计算中荧光技术的应用2.1荧光标记的表面计算DNA表面计算其基本原理是：通过DNA固定化和杂交技术，将代表所有可能存在解的不同DNA序列固定在固相表面，然后通过多次的杂交以及降解过程来筛选正解。通过荧光标记可以检测每次和最终计算的结果。2002年，Adleman组使用杂交池完成了一个20个变量的3可满足性问题6。2004年XingPingSu等在2000年Liu7的工作基础上，设计了一种通用型的DNA表面计算模型8。同年，KristianeA.Schmidt等利用单分子杂交荧光标记技术4个变量的可满足性问题9。下面以2000年，Liu等发表在nature上的DNA表面计算经典实验为例，说明其解决SAT问题的过程7。由于该问题共有16种可能性，故将代表着不同可能解的DNA片段固定在固相表面。在每一次的杂交筛选过程中，加入与固定DNA链特异性互补的DNA。那末，被杂交的固定DNA链变为双链，而未互补的单链DNA则被核酸外切酶Ⅰ降解。通过数次操作，存在于固相表面的DNA链就是每次经杂交而保留下来的DNA链，也就是代表正解的DNA链。该实验中，荧光技术主要应用在解检测的过程中：使用一条生物素标记的引物和另一条荧光标记的引物，以固相表面所有可能解的DNA片段为模版，进行PCR。利用磁珠将PCR双链产物吸附，再分离双链，分离出荧光标记的ssDNA。将这些ssDNA与经过多次杂交筛选的固相杂交，只有哪些存留在固相表面的DNA链可以杂交上，于是特定的位置就可以检测到较高荧光强度。筋篇真雪许位攀迹留甘图鲜1砌-1胜煮实验郊示意急图植电拆异围均阵旺磁怀监图解1-剑2班装列阵缩荧光甜检测顽结果艇2.令2席与歪某些糟酶切贱技术酷相结甲合的月荧光梯检测瓶利用齿酶与题DN别A践分子宇的特斑性，毁通过愉检测婆酶切恨后荧钉光量哭进行耀计算局。其统实就士是利险用任某些扑酶与跌DN症A择分子厉空间锁结构贼的相割互作私用，稻再结再合荧骂光技评术来谨共同剖实现性的。夸这种旗方法差具有诉灵敏仿度高盯，反吊应速垦度快炎等特杨点。煮其最孝大的犯优点枝就是满巧妙螺地将膏酶的蛋生物义特性吩与计孔算问钞题相腰结合欺，极用大地些丰富上了少DN股A则计算搅的手五段。怀20厌01燥年，踩Wa绍ng质等在脚上述悟表面卷计算头实验拒的基姨础上盛对解眨的检刺测又桐进行洪了新乒的改昆进，钥即将币酶切贱和荧感光技祖术相薄结合藏10跌。通伸过上责述核偿酸外染切酶乔的方病法，胞利用根新技勾术完贞成单掩链坡DN妈A浸的解苹的检句测。迹其基费本思殿想如湾下：些左侧波DN锣A供探针彼的乞3’捐端至茅少和跪右侧关杂交压的疾DN骑A耽探针采有一糟个碱保基的射重合绸，要并染使得腔右侧宿探针耐有滩5’洲端凯呈单劝链状的态。岩此时欠右侧绣探针造由深两部质分部组成附：一抓部分休是酸和目处标序爪列形波成双链链的钱；另桃一部榆分则珠是由袋非互跃补的柱5’捞端芳DN哀A框链猪组成为（见污图配2津A僚）剧。此欣时该没非互糟补的望5’扭端般DN早A主臂会救覆盖踩在上讲游寡覆核苷篮酸链母上，姥与左锈侧探浙针秒至少龙有一宏个重痒合的祸碱基涛。恰长恰在宜这重渴合的使位置施，可淹以形工成酶多切位轮点。嘉因此东，非价互补膛的积5’兵端旧DN漂A摊臂可茧以被厘切割记而释钻放。洽利用河这一宅原理凳，结诉合荧货光技浇术，婚如图辆所示眉，厦将荧捎光基议标记突在滥非互烈补辅DN防A丰链纹的巩5’进端，沃而将躲荧光嘴淬灭沟基标送记在辨重合康的酶厘切位蝶点迅3’疤端举方向狂（见蒜图雨2透B厉）学。这酸样，某只要酿酶切灵位点压被酶倒切，缠标记杯有荧治光基碧的非肆互补女的争5’肃端织DN锄A身链浇就会绑被释刮放，雅从而茧与荧进光淬候灭基骗分离磁，使字得荧女光释蛾放量驴大大俊提高险。这攻种方异法可痒以有怒效检尸测目陡的片建断是洞否存烫在。抹文中组还将翠PC史R锐方法边检测唯目的柔片断回与这伞种荧屡光检杀测法沉进行造了对消比，丈发现瘦该方编法比院PC则R素检测消具有谣更高摸的灵旗敏度然。骑图泄2泪聪实验组原理猜示意踪图惜聚愚京钳拦崖夕吴畜俯智图终3多几种服逻辑队门的辩构成溪示意腿图吓Mi山la沉n丧N.赢等孩20叫03退年研过制了扶一种术名为辽MA却YA灰的游什戏。并这是橡一种谁利用枯特殊见的苦DN缎A抖酶驶E6像（蔬一种嚼依赖贸于挠DN剪A糠的己RN椅A唯酶笛）雪构建晶起来框的逻叉辑门绕11粪。戚这种屠酶识逆别的财DN尺A哄底物吗要求捉具有蛾特殊恨结构暑（如羽3傍a栋图所蒸示）略。叼只有颗当乞上部奶寡核蔑苷酸困探针毁与旋E6势的支众架区爽互补灿，积上部双寡核牲苷酸砖才能悄被切搬断释逼放。唯将寡鲜核苷亭酸两鹅端分嘱别标永记荧姐光淬著灭基翁（如象罗丹丧明）醉和荧注光基干，那奉末只鹊有龙寡核哗苷酸抢探针掠被切贱断释鸦放，柳荧光插基才碗能有细效激体活干并盏释放杀荧光闻。室这是搜MA碍YA楚游戏开进行熊逻辑爆判断看的主茂要检晕测手痕段。尚构建阵有效令的空牛间再位阻窃是实秩现这胸个检悦测手鞠段的如关键拿。浩当寡捆核苷飘酸要探针链的结某合使城绿色匹标记刷的澡位阻锻消失驼的时燥候，举加速语酶切管反应钢；当麻寡核轻苷酸衫探针纺的结邪合使什红色泥标记杆的陶位阻错消失爽的时巨候，翼降低帆酶切按反应赠。浸基于图以上兰原理缠，构嫂建出魂以下肿几种客逻辑哪门：寻YE劲S斗型、珠NO喝T和型、溉AN县D擦型和骗AN婆D-哨AN队D-援NO于T贸型。碰YE盆S愁型谈逻辑都门没（图肤3b视所示哄）款，楼当族i1淘寡核峡苷酸社加入板时，嘱消除势原来肉i1息环状煌结构元，从怠而标杂记的巧荧光拌探针榆可以亮与之弦结合四，并录且被劳切除寒释放浮。直其判吊断船过称侵为加锐入垄i1馒，荧醋光输栗出典。宪NO粱T载型逻登辑门牧（图朵c勒所示哗）士。当窜加入会i6好时，浮环状铁结构危打开爸，荧桨光结表合的侍寡核书苷酸扩探针泄无法离结合现在互茎补区请域，胞于是烘无荧销光输丢出。砍其判打断过块程为扰加入朝i6否，荧蛇光输保出停温止。晶AN屿D神型逻高辑门品（图劈d袍所示程）实材际上回是将称两个俘YE店S刃型逻等辑门盐组装拆在一此起。库也就妻是说戏，只遵有当愉i1区和症i6拍都被夹加入碰时，残才能寒有荧抵光输躁出。匠AN崭D-昏AN照D-梅NO象T棒型逻轿辑门堵（图酬e趴）钟是更温为复悲杂的棚组合红体。仪必须验同时候加入络i1野和皱i3扁，才汗能输扎出荧盯光。凯然而你，只珠要有轰i6预存在蛇，就病不会挪输出牢荧光产。文抖中解塞决的员问题嫩是在堂3×擦3辨的棋淡盘中先完成榆3岔个棋士子档同线晨相连址。考尖察所退有的稿逻辑指情况限后，腾将所秤有可葱能的慧逻辑恳门都炭提前莲置于家棋盘秤的网脏格中齿。汇再将赏代表乖棋子嫁的寡妖核苷艇酸分企别放闻入，刚然后以观察玻荧光景输出黑情况污进行冈判断淡。射2.肤3伟与风DN泛A庙链置惯换逝相结厌合的上荧光秩技术区该技申术多赏用来紫构建县DN凶A往逻辑炮门。皱其际巧妙俘利用勉DN家A波分子熊的流粘贴女，通干过加拳入引壁发链窄，来与释放今另一鲁DN依A背链。宋在逻莫辑计榴算中纯，这留种技捏术具阵有循猫环性敌、自惑引发焰性、薯反馈衔性、领灵敏衰性和统准确赞性等始特点士。卡近年害来在垦sc钱ie领nc没e见等塘高水姿平科敢研杂离志上碗都发般表了绸大量摩系列裁工作之，而斥且在特生物馆检测侵领域校具抽有广靠泛的昼实际命应用妖前景手。侵20待00视年，羞Be摔rn荐ar划d贯Yu示rk顾e个构建酿了一败种龙DN植A丹链置捏换机松器，扯在置冻换过绪程中芳可以邪实现澡闭合健式运雨动茶1贡2令。租20妈03盗年，弄B.券Y疑ur陆ke锅等构坏建了级一种慨基于什DN脸A干链置朱换的灭纳米杜机器龙1题3喂。怪Jo埋ng惨-S母hi怨k垮Sh驻in锈等利却用可摊反复幼的D怀NA衣链置华换，击构建梁了可兄以反回复读持取和历输入株的三耍状态早存储禾器苹14雄。她20宾06趟年，形Ge蚁or要g断Se庙el私ig绢等对鞋DN御A易链相富互粘镇贴、催置换犹的几国种模灾式进创行了粪实验魄15宰。包20忘06崖年，派Si梳mo阳n展J.吩G雪re漫en龄等用冷茎环饱结构梢实现保了批DN波A树链的久粘贴们互换脱16絮。知20献07醒年，悉Da棒vi达d京Yu殖Z肝ha宴ng咽等斗实现凉了野DN萄A睛链置戏换的河循环顷进行法17遇。忙20均07筛年教,s冤uv注ir惕v田en城ka选ta注ra做ma剪n辫等实炒现了河通过煤DN啊A叉链自润粘贴修来完耳成多仙段令DN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